МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ
РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ
Нижегородської ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ПРАПОРА
ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. Н. І. Лобачевського
БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра біофізики
Реферат на тему
Методи вимірювання іонних струмів
Виконав студент
4 курсу гр.144-7
Савин А.В.
Нижній Новгород
1998
1. Метод фіксації потенціалу
Для вивчення потенціалзалежні мембранних каналів застосовується методфіксації потенціалу. У цьому методі використовують електронну систему ззворотним зв'язком, яка забезпечує автоматичну підтримкумембранного потенціалу. Різниця потенціалів по різні боки мембранифіксують на певному рівні, при цьому мембранний потенціал можнасхідчасто змінять на строго певну величину. Такий метод дозволяєвиміряти іонні струми, що протікають крізь мембрану через канали, якіактивуються при зміні потенціалу. Відповідно до закону Ома, якщонапруга на мембрані постійно, зміни струму однозначно пов'язані ззмінами провідності. У свою чергу, ми можемо фіксувати мембраннийпотенціал на різному рівні і вимірювати що виникають при цьому струми. Якщо жвикористовувати розчини з розрізненням іонним складом, і препарати,вибірково блокують той чи інший канал, то можна буде вивчатиповедінку різних іонних каналів, через які протікають вимірювані намиструми. Технічно фіксація потенціалу здійснюється в такий спосіб. Придопомоги підсилювача-регулятора внутрішньоклітинний потенціал порівнюють зкеруючим потенціалом (див. рис.1). Будь-яке відхилення мембранногопотенціалу від керуючого посилюється і на виході підсилювача виникаєкеруючий струм. Цей струм тече через електроди, розташовані по різнібоку мембрани в такому напрямку, що мембранний потенціал зновустає рівним керуючому. Таке автоматичне узгодженнявідбувається за долю мілісекунди після того, як задається ступінчастийкеруючий потенціал.
Коли у відповідь на таку ступеневу деполяризацію відкриваються натрієві
(або будь-які інші) канали, відповідні іони входять до аксон поелектрохімічного градієнту і переносять із собою електричні заряди. Цівхідні заряди прагнуть зрушити мембранний потенціал в позитивномунапрямі, проте найменше відхилення від керуючого потенціалунегайно компенсується в результаті видалення з клітин надлишковихзарядів за допомогою підсилювача-регулятора. При цьому записується той струм,який подається підсилювачем для підтримки мембранного потенціалу нанеобхідному рівні, і цей струм в точності дорівнює іонного струму, що протікаєчерез мембрану.
Метод фіксації напруги, або Кламп метод, дозволяє вимірювати іоннийпотік при переміщенні іона по контрольованому градієнтуелектрохімічного потенціалу та отримувати інформацію про електричноїпровідності мембрани та її пасивної проникності стосовноцікавить нас іона. Цей метод використовується для вимірювання вольт -амперних характеристик рослинних клітин, що дозволяє отриматиінформацію про тонкі механізми функціонування різних системмембранного транспорту.
2. Метод Петч-Кламп
Метод Петч-Кламп (patch-clamp) дозволяє здійснювати локальну
(точкову) фіксацію мембранного потенціалу та вимірювати струми через поодинокііонні канали. На даний момент цей метод є потужним засобом длядослідження біомембран. Метод дозволяє:
1. проводити багато досліджень в межах класичних електрофізіологічних підходів.
2. реєструвати струми і потенціали від клітин дуже малих розмірів (3-10 мкм)
3. реєструвати струми одиночних каналів амплітудою порядку пікоампер
4. дослідити дію лікарських препаратів при швидкому підведенні їх як до зовнішньої, так і до внутрішньої сторони мембрани
Метод Петч-Кламп був введений в дослідну практику Неером і
Сакманом, коли в 1976 році ними була опублікована стаття в журналі
"Nature", яка називалася "Токи через поодинокі канали в мембраніволокна денервірованной м'язи жаби ". Це відкрило шлях для вивчення намолекулярному рівні електричних властивостей мембран і регуляції різнихтранспортних процесів.
Основою для створення методу стало виявлення факту, що припевних умов клітинна мембрана формує дуже щільний контакт зповерхнею кінчика скляного мікроелектроди. При невеликому розрідженні,створюваному всередині піпетки, між склом і мембранним фрагментом виникаєконтакт, який має гігаомное опір. У результаті утворюєтьсяелектрично ізольований ділянку мембрани, і шум реєструючого сигналузменшується на кілька порядків. Так як контакт мембрани зі скломдуже міцний, то що знаходиться під кінчиком електрода фрагмент треба абоізолювати від клітини, або зруйнувати, і таким чином проникнути всерединуклітини. Існує кілька варіантів методу Петч-Кламп (рис.2).
Найбільш близьким до природних умов є варіант виміруіонних струмів на прикріпленій, але неушкодженою (cell-attached)клітці, оскільки досліджуваний ділянку г99земембрани не відділяється від клітиниі не порушується його зв'язок з цитоплазмою. Вимірювання на цілій клітині прируйнуванні мембрани в кінчику мікропіпеткі (whole-cell) дозволяє замінятиіонний склад цитоплазми і вивчати на діалізірованних таким чином клітинахіонні струми в режимі фіксації напруги.
Іонні струми через невеликі мембранні фрагменти вимірюють за допомогоюпіпеток, у яких діаметр кінчика можна порівняти з розмірами фрагментів.
Опір піпеток, заповнених розчином 150 ммоль/л KCl і зануренихв розчин такий же концентрації, приблизно лінійно залежить від площіотвори кінчика і варіює від 1 до 5 МОм. Площа отвору кінчикапіпетки можна варіювати від 1 до 8 мкм2, змінюючи ступінь нагрівання спіраліна останньому етапі витягування. Ці розміри знаходяться на межі дозволусвітлового мікроскопа. Зовнішню поверхню покривають гідрофобним матеріалом
- Сілгардовой гумою. Особливістю незастившего сілгарда є йогоздатність розтікатися тонкою плівкою по поверхні скла на декількаміліметрів, покриваючи при цьому і кінчик мікроелектроди. Так як високоомніконтакти утворюються тільки з чистим склом, цю плівку необхідно видалятитільки оплавленням мікроелектродів. При роботі на мембранних фрагментахвикористовується кілька типів піпеток.
Піпетки з тугоплавкого скла отримали у практиці більше застосування,ніж піпетки з м'якого скла. Перші мають більше питомий опір,ніж м'яке скло з більш низькою температурою плавлення. Внаслідок цьоговнесок шуму, обумовленого ємністю зв'язку через скляну стінку впіпеткою з тугоплавким склом менше.
Піпетки з товстостінного тугоплавкого скла мають ряд переваг. По -перше, при більшій товщині стінок шунтуючі провідність через скломенше. По-друге, на деяких препаратах гігаомние контакти більшестабільні і величина їхнього утворення значно більше, ніж для аналогічних
тонкостінних піпеток
Табл.1. Геометричні параметри
кінчиків піпеток, що виготовляються з різних типів ст. капілярів
| Матеріал, з якого | Площа | Площа | Ширина | Кут |
| виготовлені піпетки | отвори | кільця, | кільця, | конуса, |
| | Ямкм2 | мкм2 | | |
| | | | Мкм | град |
| Тонкостінні | 1.0 | 0,79 | 0,19 | 24 |
| капіляри CEE BEE - | | | | |
| м'яке скло | | | | |
| Кімакс - тверде | 1,2 | 0,82 | 0,2 | 20 |
| боросилікатне скло | | | | |
| Алюмінієве - тверде | 1,0 | 0,9 | 0,22 | 25 |
| алюмосилікатні | | | | |
| скло | | | | |
| Тонкостінні | 1,01 | 1,71 | 0,39 | 10 |
| капіляри Jencons - | | | | |
| тверде | | | | |
| боросилікатне скло | | | | |
Мембранні фрагменти
При роботі з деякими клітинами, наприклад, з ізольованими за допомогоюферментів клітинами міокарда, гігаомние контакти іноді формуютьсяспонтанно, при дотику кінчиком піпетки до поверхні клітинивисокоомний контакт формується без подсасиванія. У цьому випадку неспостерігається ніяких деформацій клітинних мембрани, і площа мембранногофрагмента можна оцінити за значенням опору піпетки до освітиконтакту. Але в більшості випадків контакт формується тільки при невеликомурозрідженні, що створюється всередині піпетки. При цьому поверхня мембранидеформується, частина її втягується всередину піпетки на 2-3 мкм, приймаючи Q -подібну форму. Коли фрагмент ізолюють механічним відведенням кінчикапіпетки від поверхні клітини, його У-образна форма практично незмінюється. При подальшому подсасиваніі утворюється сферичний бульбашку.
Якщо відома питома ємність мембрани (як правило, вона складає 1мкф/см2), площа фрагмента можна оцінити за величиною його ємності; зазвичайплоща варіює від 2 до 25 мкм2.
Електронні схеми для Петч-Кламп реєстрації
Електронна схема Петч-Кламп реєстрації повинна мати такі параметри,щоб було можливим зареєструвати пересування всього лише декількохсотень елементарних електричних зарядів через мала ділянка клітинноїмембрани. При максимально знижених власних шумах вимірювальноїапаратури, струми через поодинокі електровозбудімие Са-канали, можназареєструвати тільки в нефізіологіческіх умовах - наприклад, привикористанні розчинів, що містять Ва2 + замість Са2 +.
Стандартним методом вимірювання малих струмів є реєстраціястворюваного ними падіння напруги на високоомним опорі. На рис.3представлений три електричні ланцюги, за допомогою яких здійснюютьсяподібні вимірювання. Найбільш зручно автоматичне підтримання необхідногозначення Vб за допомогою операційного підсилювача, який являє собоюкерований потенціалом джерело напруги (рис.3, в).
Реєстрація від цілої клітини в умовах щільного контакту
Незважаючи на те, що метод Петч-Кламп був розроблений для реєстрації струмівчерез поодинокі канали, Петч-піпетки можна з успіхом використовувати також дляреєстрації струмів від цілої клітини (РЦК), особливо коли розміри їїневеликі. Після утворення гігаомного контакту мембранний фрагмент підпіпеткою можна зруйнувати, прикладаючи до неї короткі імпульсинегативного тиску. Така маніпуляція в більшості випадків непорушує контакту піпетки з мембраною, і в результаті між піпеткою тавмістом клітини встановлюється добре ізольований від омиваєрозчину провідний шлях. Такий спосіб проникнення в клітину завдає їйнабагато менше ушкоджень, ніж введення стандартного мікроелектроди.
Вхідний опір невеликих клітин велика в порівнянні з ефективнимопором кінчика піпетки, тому при роботі з ними електричнівимірювання можна проводити від ділянки мембрани набагато більшої площі, ніжу початкового фрагмента. На відміну від різних варіантів ПК реєстрації цейметод дозволяє здійснити реєстрацію від мембрани цілої клітини, а не відмаленького мембранного фрагмента.
Для реєстрації на цілій клітині Петч-піпетки заповнюють відповіднимрозчином з низькою концентрацією іонів кальцію. Піпетку притискають доповерхні клітинної мембрани, в результаті чого формується високоомнийконтакт. Потім потенціал піпетки змінюють до від'ємного значення іподають імпульси напруги з амплітудою в декілька міллівольт. На цьомуетапі проводиться компенсація швидкої ємнісний компоненти, обумовленоїємністю власника і стінок піпетки. До піпетці прикладають імпульсинегативного тиску до тих пір, поки знову не з'являться ємнісніперехідні процеси (виникає додатковий струм).
Реєстрацію від цілої клітини можна проводити протягом години без візуальнихабо електричних ознак порушення мембрани. Якщо досліджувана клітинащільно прикріпилася до культуральній чашці, плавним відведенням її від піпеткиможна отримати конфігурацію outside-out. Після такої процедури клітиннамембрана швидко "зашивається" і клітина є інтактною. Але вмістклітини відповідає розчину в піпетці. Це використовується в різнихцілях:
1. для зміни вмісту вибраної клітини з мінімальним пошкодженням її мембрани.
2. Для проведення досліджень з різними внутрішньоклітинними розчинами на одній і тій же клітині шляхом зміни реєструють піпеток.
3. Для реєстрації в одному експерименті інтегральних струмів і поодиноких каналів.
Піпетки повинні бути порівняно широкими і мати кінчики з великим кутомсходження.
Тим розчином в піпетці та вмістом клітини відбувається швидкий обмін,тому розчин для заповнення піпеток повинен бути близький за своїм складомдо клітинного вмісту.
Таб. 2. Типовіелектричні параметри, отримані під час реєстраціїна хромафінної клітинах в конфігурації РЦК
| Послідовне опір, | 4 МОм |
| Rs | |
| Ємність клітини, C | 5 пФ |
| Пост. Часу фіксації | 20 мкс |
| потенціалу, RsC | |
| Пост. Часу обміну іонів, tоб | 5с |
| Опір клітини, R | 10ГОм |
| Опір витоку, Rут | 20ГОм |
| Шум (среднеквадр. значення, 0-400 | 0,15 ПА |
| Гц) | |
Дані таблиці відрізняються від значень, отриманих із звичайними склянимимікроелектродами за трьома основними пунктами:
1. більшість клітин з діаметром менш 20 мкм при проколюванні звичайним мікроелектродів пошкоджується, у той час як РЦК можна проводити навіть на клітинах діаметром менше 10 мкм, абсолютно не порушуючи їх.
2. Опір витоку мікроелектроди-клітка при використанні звичайних мікроелектродів не перевищує 500 МОм, у той час як відповідне значення опору витоку при РЦК можуть бути 20 ГОм і більше.
3. Звичайні мікроелектроди мають опір кінчика Rs більше 100 МОм, а типові значення для РЦК на хромафінної клітинах становлять 4 МОм.
Метод РЦК застосовується для реєстрації струмів у мембрані пухлинних клітингіпофіза, внутрішніх сегментів паличок сітківки, острівцевих клітинпідшлункової залози, клітин міокарда, зовнішніх сегментів паличок сітківки,нейронів спинного мозку ссавців і ін
Петч-Кламп реєстрація при нещільно контакті
Метод реєстрації від цілої клітини в умовах щільного контакту дозволяєреєструвати іонні струми, що протікають через невеликі мембранніфрагменти, які містять тільки один або кілька іонних каналів. Дляотримання інформації про кінетику роботи каналів або про щільність струмів черезмембрану проводиться одночасна реєстрація роботи множинних каналівз використанням методу Петч-Кламп або застосовується класичний методфіксації мембранного потенціалу.
Регистрация при нещільно контакті по суті ідентична реєстрації одиночнихканалів, за винятком того, що ділянка мембрани, на якому фіксуєтьсяпотенціал, на 3 порядка больше, і при цьому не потрібно формуваннягігаомних контактів.
Метод дозволяє без зусиль отримувати стабільні електрофізіологічнідані від локальних ділянок мембрани, використовуючи інтактні клітинипрактично без їх ізоляції або інших видів обробки. Наприклад, можнапроводити вимірювання на цілій м'язі, не виділяючи поодинокі клітини. Відпадаєнеобхідність і у використанні внутрішньоклітинних мікроелектродів.
Однак, необхідно відзначити, що найбільш коректну інформацію промембранної провідності все-таки дає реєстрація струмів через поодинокіканали, тому що дозволяє позбутися від ряду артефактів, які можуть бутиотримані при реєстрації макроскопічного струму. Є, принаймні,чотири основні проблеми, з якими доводиться стикатися приреєстрації макроскопічних струмів. По-перше, важко створити умови дляреєстрації струму тільки через канали, що цікавить нас типу. По-друге,вплив послідовного опору може призводити до різниці між істинним мембранним і підтримуванихпотенціалом. По-третє, накопичення іонів у прімембранной області можевикликати залежне від часу зміна струму через окремі канали. І,нарешті, потенціал-залежність провідності відкритого каналу може бутипомилково прийнята за потенціал-залежність активації каналу.
Література:
1. Медведєв С.С. Електрофізіології рослин. - СПб.: Изд-во
С-Петебурзі. ун-та, 1998. - 184 с.
2. Реєстрація одиночних каналів/під ред. Сакмана Б. і
Неера Е. - М.: "Мир", 1991
3. Еккерт Р., Ренделл.Д, Огастін Дж. - Фізіологія тварин, механізми і адаптація. - М.: "Мир", 1991
4. Hedrich R., Schroeder.J.I. and Fernandez J.M. - Patch-clamp studies on higher plant cells: a perspective.// Trends biochemistry science.
- 1987. - V.12. pp. 49-52 &
-----------------------< br>
