Мурманський державний технічний університет

Кафедрабіології

Доповідь на тему:

"Методи дослідження в цитології"

Виконав:

Студентка 1-го курсу

Технічного факультету

Кафедри Біологія

Серебрякова Лада В'ячеславівна

Перевірив:

Мурманськ 2001

План :
1. Що вивчає цитологія.
2. Уявлення про те, що організми складаються з клітин.
3. Методи дослідження, застосовувані в цитології.
4. Фракціонування клітин.
5. Радіоавтографія.
6. Визначення тривалості деяких стадій клітинного циклу методомрадіоавтографіі.

Цитологія - наука про клітину. З середовища інших біологічних наук вонавиділилася майже 100 років тому. Вперше узагальнені відомості про будовуклітин були зібрані в книгу Ж.-Б. Карнуа «Біологія клітини», що вийшла в
1884 році. Сучасна цитологія вивчає будову клітин, їхфункціонування як елементарних живих систем: досліджуються функціїокремих клітинних компонентів, процеси відтворення клітин, їхрепарації, пристосування до умов середовища і багато інших процеси,що дозволяють судити про загальні для всіх клітин властивості і функції. Цитологіярозглядає також особливості будови спеціалізованих клітин. Іншимисловами, сучасна цитологія - це фізіологія клітини. Цитологія тіснопов'язана з науковими та методичними досягненнями біохімії, біофізики,молекулярної біології і генетики. Це стало підставою для поглибленоговивчення клітини вже з позицій цих наук і появи певної синтетичноїнауки про клітині - біології клітини, або клітинної біології. В даний частерміни цитологія і біологія клітини збігаються, тому що їх предметомвивчення є клітина з її власними закономірностями організації тафункціонування. Дисципліна «Біологія клітини» відноситься до фундаментальнихрозділам біології, тому що вона досліджує й описує єдинуодиницю всього живого на Землі - клітину.

Тривалий і пильне вивчення клітини як такої призвело доформулювання важливого теоретичного узагальнення, що має загально біологічнихзначення, а саме до появи клітинної теорії. У XVII ст. Роберт Гук,фізик і біолог, що відрізнявся великою винахідливістю, створив мікроскоп.
Розглядаючи під своїм мікроскопом тонкий зріз пробки, Гук виявив, щовона побудована з малесеньких нічим не заповнених клітинок, розділенихтонкими стінками, які, як це нам тепер відомо, складаються зцелюлози. Він назвав ці маленькі осередки клітинами. Надалі, колиінші біологи почали досліджувати під мікроскопом рослинні тканини,виявилося, що маленькі осередки, виявлені Гуком в мертвій мав сухупробці, є і в живих рослинних тканинах, але в них вони не пусті, амістять кожна по маленькому драглистому бичка. Після того, якмікроскопічному дослідженні піддали тварини тканини, було встановлено,що вони також складаються з дрібних драглисті теля, але що ці тільця лишев окремих випадках відокремлені один від одного стінками. У результаті всіх цихдосліджень у 1939 р. Шлейден і Шванн незалежно один від одногосформулювали клітинну теорію, говорить, що клітини являють собоюелементарні одиниці, з яких в кінцевому рахунку побудовані всі рослини івсі тварини. Протягом якогось часу двоякий зміст слова клітина щевикликав деякі непорозуміння, але потім він міцно закріпився за цимималенькими желеподібний тільцями.

Сучасне уявлення про клітці тісно пов'язано з технічнимидосягненнями та удосконаленнями методів дослідження. Крім звичайноїсвітлової мікроскопії, не втратила своєї ролі, в останні кількадесятиліть велике значення придбали поляризаційна, ультрафіолетова,флюоресцентна, фазовоконтрастная мікроскопія. Серед них особливе місцезаймає електронна мікроскопія, роздільна здатність якої дозволилапроникнути і вивчити субмікроскопіческую і молекулярну структуру клітини.
Сучасні методи дослідження дозволили розкрити детальну картинуклітинної організації.

Кожна клітина складається з ядра і цитоплазми, відокремлених один від одногоі від зовнішнього середовища оболонками. Компонентами цитоплазми є: оболонка,гіалоплазма, ендоплазматичної мережа і рибосоми, апарат Гольджі, лізосоми,мітохондрії, включення, клітинний центр, спеціалізовані органели.

Частина організму, що виконує якусь особливу функцію, називаютьорганом. Будь-який орган - легке, печінка, нирка, наприклад - кожен має своюособливу структуру, завдяки якій він відіграє певну роль уорганізмі. Точно так само в цитоплазмі є особливі структури, своєріднебудова яких дає їм можливість нести певні функції,необхідні для метаболізму клітини; ці структури називають органелами
( «Маленькими органами »).

З'ясування природи, функції та розподілу органел цитоплазми сталоможливим лише після розвитку методів сучасної біології клітини. Найбільшкорисними в цьому відношенні виявилися: 1) електронна мікроскопія; 2)фракціонування клітин, за допомогою якого біохіміки можуть виділятищодо чисті фракції клітин, які містять певні органели, івивчати, таким чином, окремі питання, що цікавлять їх метаболічні реакції;
3) радіоавтографія, що зробила можливим безпосереднє вивчення окремихметаболічних реакцій, що протікають в органелах.

Метод, за допомогою якого органели виділяють з клітин, називаютьфракціонування. Цей метод виявився дуже плідним, давши біохімікамможливість виділяти різні органели клітини у відносно чистому вигляді.
Він дозволяє, крім того, визначати хімічний склад органел іщо містяться в них ферменти і на підставі отриманих даних робити висновкипро їх функції в клітині. В якості першого кроку клітини руйнують шляхомгомогенізації в якій-небудь підходящої середовищі, яке забезпечуєзбереження органел і запобігає їх агрегацію. Дуже часто для цьоговикористовують розчин сахарози. Хоча мітохондрії і багато інших клітинніорганели залишаються при цьому неушкодженими, такі мембранні переплетення,як ендоплазматичний ретикулум, а також плазматична мембрана,розпадаються на фрагменти. Однак утворюються фрагменти мембран нерідкозамикаються самі на себе, в результаті чого утворюються округлі бульбашкирізних розмірів.

На наступному етапі клітинний гомогенат піддають рядуцентрифугування, швидкість і тривалість яких всякий раззростає; цей процес називається диференціальних центрифугуванням.
Різні органели клітини осідають на дні центріфужних пробірок прирізних швидкостях центрифугування, що залежить від розмірів, щільності таформи органел. Утворюється осад можна відібрати й досліджувати. Швидшевсіх осаджуються такі великі і щільні структури, як ядра, а дляосадження більш дрібних і менш щільних структур, таких, як бульбашкиЕПР, потрібні більш високі швидкості і більшетривалий час. Тому при низьких швидкостях центрифугирования ядраосідають, а інші клітинні органели залишаються в суспензії. При більшвисоких швидкостях осаджуються мітохондрії і лізосоми, а при триваломуцентрифугування і дуже високих швидкостях в осад випадають навіть такідрібні частинки, як рибосоми. Опади можна досліджувати за допомогоюелектронного мікроскопа, щоб визначити чистоту отриманих фракцій. Всіфракції до деякої міри забруднені іншими органелами. Якщо тим неменш вдається домогтися достатньої чистоти фракцій, то їх піддають потімбіохімічному аналізу, щоб визначити хімічний склад і ферментативнуактивність виділених органел.

Порівняно недавно був створений інший метод фракціонування клітин
- Центрифугування в градієнті щільності; при цьому центрифугуваннявиробляють в пробірці, в якій попередньо нашаровуються один на одногорозчини сахарози все зростаючої концентрації, а отже, ізростаючої щільності. При центрифугування що містяться в гомогенаторганели розташовуються в центріфужной пробірці на тих рівнях, на якихзнаходяться розчини сахарози, відповідні їм по щільності. Цей методбіохімікам дає можливість розділяти органели однакових розмірів, алерізної щільності (рис. 1 .).

Радіоавтографія - порівняно новий метод, безмірно розширивможливості як світловий, так і електронної мікроскопії. Це у вищійступеня сучасний метод, зобов'язаний своїм виникненням розвитку ядерноїфізики, яке зробило можливим одержання радіоактивних ізотопіврізних елементів. Для радіоавтографіі необхідні, зокрема, ізотопитих елементів, які використовуються клітиною або можуть зв'язуватися зречовинами, що використовуються клітиною, і які можна вводити тваринам абододавати до культур в кількостях, що не порушують нормального клітинногометаболізму. Оскільки радіоактивний ізотоп (або позначений їм речовина)бере участь у біохімічних реакціях так само, як його нерадіоактивні аналог,і в той же час випускає випромінювання, шлях ізотопів в організмі можнапростежити за допомогою різних методів виявлення радіоактивності. Один зспособів виявлення радіоактивності заснований на її здатності діятина фотоплівку подібно світлу, але радіоактивне випромінювання проникає крізьчорний папір, що використовується для того, щоб захистити фотоплівку від світла, інадає на плівку таку ж дію, як світло.

Щоб на препаратах, призначених для вивчення за допомогою світловогоабо електронного мікроскопів, можна було виявити випромінювання, що випускаєтьсярадіоактивними ізотопами, препарати покривають в темному приміщенні особливоїфотоемульсій, після чого залишають на деякий час в темряві. Потімпрепарати проявляють (теж у темряві) і фіксують. Ділянки препарату,що містять радіоактивні ізотопи, впливають на що лежить над нимиемульсію, в якій під дією випускається випромінювання виникають темні
«Зерна». Таким чином, отримують радіоавтографи (від грец. Радіо --лучевідний, аутос - сам і графо - писати).

Спочатку гістології мали у своєму розпорядженні лише кількома радіоактивнимиізотопами; так, наприклад, у багатьох ранніх дослідженнях із застосуваннямрадіоавтографіі використовувався радіоактивний фосфор. Пізніше сталивикористовувати значно більше таких ізотопів; особливо широке застосуваннязнайшов радіоактивний ізотоп водню - тритій.

Радіоавтографія мала і має до цих пір дуже широке застосування длявивчення того, де і як в організмі протікають ті чи інші біохімічніреакції.

Хімічні сполуки, мічені радіоактивними ізотопами, яківикористовуються для дослідження біологічних процесів, називаютьпопередниками. Попередники - це звичайно речовини, подібні до тих,які організм одержує з їжі; вони служать будівельними блоками дляпобудови тканин і включаються в складні компоненти клітин і тканин такимже чином, як у них включаються немечение будівельні блоки. Компоненттканини, в який включається мічений попередник і який випускаєвипромінювання, що називається продуктом.

Клітки, що вирощуються в культурі, хоча і належать до одного і тогож типу, в будь-який даний момент часу будуть знаходитися на різних стадіяхклітинного циклу, якщо не вжити спеціальних заходів для синхронізації їхциклів. Тим не менш, шляхом введення в клітини тритій-тимідину іподальшого виготовлення радіоавтографов можна визначититривалість різних стадій циклу. Час настання однієї стадії --мітозу - можна визначити і без міченого тимідину. Для цього вибірку клітинз культури тримають під спостереженням у фазово-контрастному мікроскопі, якийдає можливість безпосередньо стежити за перебігом мітозу і встановлюватийого терміни. Тривалість мітозу зазвичай дорівнює 1 год, хоча в клітинахдеяких типів він займає до 1.5 ч.

Визначення тривалості G 2-періоду.

Для визначення тривалості G 2-періоду застосовують метод,відомий під назвою імпульсної мітки: до культури клітин додаютьмічений тимідину, а через короткий час замінюють культуральну середусвіжою, з тим, щоб запобігти подальшому поглинання клітинами міченоготимідину. При цьому позначку включають тільки в ті клітини, які протягомкороткочасного перебування в середовищі з тритій-тимідину знаходилися в S -періоді клітинного циклу. Частка таких клітин невелика і лише невелика частинаклітин отримає позначку. Крім того, всі клітини, що включають позначку, будутьперебувати в інтерфазі - від клітин, тільки-но вступили в S-період, до таких,які майже закінчили його за час дії тритій-тимідину. У пробі,взятої відразу після видалення міченого тимідину, позначка міститься тільки вінтерфазних ядрах, що належать клітинам, які в період діїмітки знаходилися в S-періоді; ті ж клітини, які в цей періодперебували в стані мітозу, залишаються немеченимі.

Якщо потім продовжувати відбирати з культури проби через певніпроміжки часу і виготовляти для кожної послідовної пробирадіоавтограф, то настане момент, коли мітка почне з'являтися вмітотичних d-хромосомах. Мітки будуть включатися у всі ті клітини,які в період наявності в середовищі тритій-тимідину знаходилися в S-періоді,причому серед цих клітин будуть як тільки що вступили в S-період, так імайже закінчили його. Цілком очевидно, що ці останні першими середмічених клітин пророблять мітоз і, отже, в їх мітотичниххромосомах виявиться мітка. Тим самим проміжок між 1) часом, колиз культури був видалений мічений тимідину, і 2) часом появи міченихмітотичних хромосом буде відповідати тривалості G 2-періодуклітинного циклу.

Визначення тривалості S-періоду.

Оскільки клітини, які знаходяться в момент введення в середу мітки в самомуНаприкінці S-періоду, першими наберуть мітоз, то, отже, в тих клітинах,у яких S-період починається безпосередньо перед видаленням мітки,мічені мітотичний хромосоми з'являться в останню чергу. Тому, якщоб нам вдалося визначити проміжок між часом вступу в мітозклітин, позначених першими, і клітин, що помічені останніми, ми встановилиб тривалість S-періоду. Однак, хоча час, коли впершез'являються мічені мітотичний хромосоми, встановити легко, часвступу в мітоз клітин, що помічені останніми, визначити неможливо
(цьому перешкоджає дуже велика кількість мічених діляться клітин уостанніх пробах). Тому тривалість S-періоду доводитьсявизначати іншим способом.

При дослідженні радіоавтографов послідовних проб клітин,відбираються через однакові проміжки часу, виявляється, що часткаклітин, які мають позначку в своїх мітотичних хромосомах, поступовозростає, поки міченими не виявляться буквально все що діляться клітини.
Однак, у міру того як клітини одна за одною завершують мітоз, вониперетворюються на мічені інтерфазних клітини. Першими завершують мітоз ті змічених клітин, які вступили в нього першими, і відповідно з клітинз міченими мітотичним хромосомами останніми завершують мітоз ті, яківступили в нього пізніше за всіх. Оскільки тривалість мітозу завждиоднакова, то, отже, якщо б ми могли визначити проміжок між:
1) часом закінчення мітозу в клітинах, які додали мітку першими, і 2)часом закінчення мітозу в клітинах, які додали мітку останніми, мивстановили б тривалість S-періоду. Тривалість S-періодуневажко встановити, визначивши проміжок між: 1) моментом часу, коли
50% мітотичних клітин в культурі несуть позначку, і 2) моментом часу,після якого культура вже не містить 50% мічених клітин.

Визначення часу створення (загальної тривалості всьогоклітинного циклу).

Продовжуючи відбирати з культури проби клітин, можна виявити, щомічені фігури мітозу в якийсь момент зовсім зникають, а потімз'являються знову. Такі що діляться клітини являють собою дочірніклітини, що походять від тих материнських клітин, які включили позначку,перебуваючи в момент впливу тритій-тимідину в S-періоді. Ці материнськіклітини перейшли в S-період, розділилися, а потім пройшли через другуінтерфазу і другий поділ, тобто виконали один повний цикл і частинанаступного. Час, необхідний для проходження повного клітинного циклу,називається часом генерації. Воно відповідає проміжку між двомапослідовними піками включення мітки і зазвичай соотвідповідне відрізкуміж тими точками послідовних висхідних кривих, у яких 50% фігурмітозу містять позначку.
Література.
А. Хем, Д. Кормак «Гістологія», том 1 Москва «МИР» 1982;
М. Г. Абрамов «Клінічна цитологія» Москва «МЕДИЦИНА» 1974;
Ю. С. Ченцов «Загальна цитологія»