ЗМІСТ

1. Транспорт цисплатину

2

2. Внутрішньоклітінна мішень цисплатину

4

3. Вплив цисплатину на клітинний цикл та індукція апоптозу 5

4. Механізми резистентності пухлинних клітин до цисплатину 7

4.1. Механізми клітинної резистентності на рівні цитоплазматичної мембрани

7

4.2. Внутрішньоклітінні тіолові детоксікуючі системи

9

4.2.1. Система глутатіону

9

4.2.2. Металотеонеіні

10

4.3. Репарація пошкоджень ДНК

11

4.4. Зміни генома, що асоційовані з резистентністю до цисплатину

15

Список використаних джерел

21

Цисплатин є одним з найбільш загальновживаних препаратів у лікуванні солідних пухлин людини. Однак ефективне застосування цисплатину у клініці часто лімітується токсичністю препарату та розвитком резістенстності до нього. Резистентність до цисплатину має комплексний характер і пов `язана з рядом особливостей пухлинних клітин, включаючи зміни в проникності цитоплазматичної мембрани, підвищення активності детоксікуючіх та репаративних систем клітини, порушення експресії генів fos, nm23, p53, mdm2, bcl-2 та інші.

Порушення біохімічних сигнальних шляхів апоптозу також можуть бути основою для розвитку резистентності. Розуміння молекулярних основ дії цисплатину та механізмів розвитку резистентності до нього дозволять значно покращити результати клінічних випробувань препарату.

1.Транспорт цисплатину

Взаємодія цисплатину з плазматичних мембраною є першою щаблях багатостадійного процесу реалізації цитотоксичність ефекту препарату.

Ступінь пошкодження мембран цитостатиків залежить від текучості їх ліпідної компоненти, яка визначається швидкістю проходження процесів перекисного окислення ліпідів [1].

На сьогодні існують дві гіпотези поглинання препарату пухлиною клітиною. Більш аргументована гіпотеза пасивного транспорту, основана на фактах відсутності інгібування переносу цисплатину за допомогою його структурних аналогів та проникнення цисплатину в клітину без насичення до межі його розчинності у культуральному середовищі [2]. Але ряд вчених відстоює ідею існування активного транспортера цисплатину. У 1984 році був відкритий інгібітор синтезу протеінів бензальдегід, який послаблювала цитотоксичних ефект цисплатину за рахунок зменшення його накопичення в клітині. Інший відомий інгібітор білкового синтезу - ціклогексамід не мав такого ефекту. Це й стало основою для заключення, що бензальдегід якимось чином безпосередньо реагує з мембранним білком-транспортером, уповільнюючі таким чином проникнення цисплатину у клітину [3].

піздніше було знайдено, що альдегідні похідні піридоксаль та піридоксаль-5 - фосфат також значно послаблюють цитотоксичну активність цисплатину. Відомо, що ці речовини утворюють основи Шиффа з аміногрупамі на поверхні клітини. Було показано, що і бензальдегід і інші похідні інгібують проникнення цисплатину у клітину на 50% у порівнянні з контролем. Є дані про те, що попередня інкубація клітин з інгібітором Nа/К АТФ-ази уабаіном також зменшує проникнення цисплатину у клітину на 50%. Подальші дослідження у цьому напрямку показали, що безпосередньо Nа/К АТФ-аза не є транспортером цисплатину, однак транспорт ліків Na-залежний, а також залежить від мембранного потенціалу клітини [4,5].

Розглянемо загальновживану модель акумулювання цисплатину в клітині, яка влаштовує прибічників обох гіпотез. Швидке накопичення половини цисплатину у клітині проходить за рахунок пасивної дифузії, тоді як інша половина транспортується через канали, що закриваються.

Якщо активність останніх заблоковано, то можна очикувати зменшення проникнення цисплатину в клітину на 50%. Дані про регуляцію активності каналів дозволяють зробити висновок, що проходження цисплатину через них регулюється каскадом реакцій фосфорилювання, що ініціюються протеінкіназою А (РКА), протеінкіназою С (РКС) чи кальмодулінзалежнімі кіназамі [3]. Здатність мембранонепронікніх альдегідніх похідних блокувати накопичення цисплатину у клітині на

50% обумовлюється реактівністю зовнішніх аміногруп білків, що формують такий канал. Той факт, що інгібування початкового потоку цисплатину у клітину на 50% відбувається за допомогою уабаіна, підтверджує, що повний мембранний градієнт, зумовлений Na/K АТФ-азою, важливий для роботи каналів.

Bіведення цисплатину з клітини -- двохфазній процес з дуже короткою почaтковою фазою тривалістю 5 хв та більш довгою кінцевою фазою [6,7]. Встановлено існування АТФ-залежного переносника цисплатину кон `югованого з глутатіоном [8,9]. Описана АТФ-залежна глутатіон-S-кон `югат експортуючи помпа (ГS-Х-помпа), що має широкий спектр субстратної специфічності та транспортує органічні аніоні, лейкотрієн С4 та інші сполуки, що несуть великі гідрофобні ділянки та хоча б два від` ємні заряди. ГS-Х-помпа виводить потенційно токсичні кон `югаті глутатіон-S-платина (ГS-Pt) з пухлинних клітин, таким чином беручи участь в формуванні резистентності клітин до цисплатину [10].

2.Внутрішньоклітінна мішень цисплатину.

Внутрішньоклітінною мішенню цисплатину є ДНК, з якою препарат ковалентно зв `язується. Біфункціональні продукти взаємодії цисплатину з ДНК, що називаються цисплатин-ДНК-адукті, блокують реплікацію, транскрипцію і, як наслідок, - клітинну проліферацію. Цисплатин діє на 7-му позицію залишки гуаніна та формує декілька типів адуктів з основами ДНК. Два основні адукті це GG внутрішньоланцюгові зшівкі

(складають 60-65% усіх адуктів), AG внутрішньоланцюгові зшівкі (20 -

25% усіх адуктів), а також міжланцюгові та ДНК-білкові зшівкі [11].

Після дії цисплатину основна кількість адуктів утворюються вже через

6-12 годин [12]. Формування адуктів відбувається в два етапи.

Спочатку має місце швидкий етап алкілування: один ланцюг ДНК формує цисплатин-моноадукт. Далі повільна фаза: реакція з `єднання з другим ланцюгом.

Більшість робіт у напрямку дослідження взаємодії цисплатину та

ДНК стосується ядерної ДНК. Але в останні роки вчених зацікавила у цьому відношенні мітохондріальна ДНК. Виявилось, що ця ДНК у 4-50 разів (для різних модельних систем) більш чутлива до пошкоджуючих ефекту цисплатину, ніж ядерна ДНК [13,14]. А у зв `язку з сучасними уявленнями про роль мітохондрій у реалізації програми апоптозу цей факт набуває нового значення.

3.Вплів цисплатину на клітинний цикл та індукція апоптозу.

Відомо, що у багатьох модельних системах in vitro цисплатин НЕ е. фазоспеціфічнім протипухлинних препаратом. Пухлинні клітини у різних фазах клітинного циклу однаково чутливі до нього [15]. Але дані деяких досліджень свідчать про те, що все таки у фазі G2/M клітини є більш чутливими до дії цитостатика [16]. Низькі концентрації цисплатину у клітинах викликають уповільнене проходження

S-фази і зупинку у G2/M-фазі клітинного циклу [17]. В залежності від концентрації препарату і, відповідно, пошкодження ДНК, клітина після

G2/M-зупінкі вступає в наступну фазу клітинного циклу - мітоз, або входити в апоптоз. Щодо дії цитостатика на регулятори клітинного циклу, то встановлено, що цисплатин не впливає на внутрішньоклітінній вміст цікліну А [18]. Але при дії препарату збільшуються рівні цікліну В, p34cdc2 а також зростає активність гістон Н1-кіназі [19].

Після дії цисплатину підвищується експресія цікліну D1, cdk4, а також збільшується рівень фосфорилювання білка ретинобластоми, тобто з ` являються усі ознаки руху клітини по клітинному циклу [20]. І дійсно, якщо обробляти цисплатином клітини, що знаходяться у стані спокою (G0), вони виходять у G1-фазу, повільно проходять S-фазу і зупиняються у G2/M-фазі клітинного циклу.

Після пошкодження ДНК цисплатином у клітинах відбувається збільшення експресії білка р53 і р53-залежне підвищення експресії білка р 21, який і спричиняє зупинку клітинного циклу [21].

Субтокічні дози цисплатину індукують загибель клітин за типом апоптозу, з усіма характерними біохімічними та морфологічними ознаками процесу: екстерналізацією фосфотіділсеріну, активацією каспаз, фрагментацією ДНК, утворенням апоптічніх тілець [22-24].

В багатьох модельних системах in vitro показано, що лікарські протіпухлінні препарати, в тому числі і цисплатин, викликають підвищення експресії поверхневого рецептора Fas, що потребує синтезу білка de novo [25], а також його ліганда FasL [26]. Але на сьогодні вважається, що індукований проітіпухліннімі ліками апоптоз не є залежним від активації безпосередньо Fas-системи, оскільки вживання антагоністичних анти-CD95 моноклональних антитіл не впливали на розвиток апоптозу під дією цітостатіків [27].

Особливо цікавими є дані щодо ефекторним механізмів апоптозу, індукованого цисплатином. Відомо, що у цьому процесі бере участь каспаз-3, оскільки застосування її інгібіторів білка CrmA та Z-VAD-

CH2DCB призводить до гальмування апоптозу, спричиненого цитостатиків

[28,29] . Каспаз-3 активує інші каспаз, крім того розщіпляє фактор ініціації трансляції 4G (eIF4G), що призводить до гальмування синтезу білка [30].

4.Механізмі резистентності пухлинних клітин до цисплатину.

4.1.Механізмі клітинної резистентності на рівні цитоплазматичної мембрани

Одним з основних механізмів клітинної резистентності до цисплатину розглядають особливості будови цитоплазматичної мембрани та прямого та зворотнього транспорту крізь неї.

Однією з особливостей пухлинних клітин , резистентних до дії цисплатину, є зменшена у порівнянні з чутливими клітинами Акумуляція препарату [31,32].

Дана модель пояснює, чому так багато клітинних ліній резистентних до дії цисплатину відрізняються зменшений накопиченням цисплатину. Мутації, що призводять до змін структури каналів чи гіперполярізації клітинної мембрани, можуть спричинити виникнення резистентного клону клітин.

Нещодавно до клітин мішіної лімфоми R1.1, резистентних до дії цисплатину були одержані антитіла, які реагували з глікопротеідом з молекулярною масою 200кД, гіперекспресованім на поверхні цих клітин. Кількість білка на клітинній поверхні знаходилась у зворотній залежності від акумулювання цисплатину у клітинах та корелювала з рівнем їх чутливості до цисплатину. Було запропоновано, що даний білок може бути аналогом Р-глікопротеіда (Pgp) і є непрацездатним каналом, що гіперекспресованій на клітинній поверхні для компенсації дефектної функції [33].

У резистентних до цисплатину клітинах з підвищеним вмістом глутатіона часто спостерігається гіперекспресія ГS-Х-помпи. В цитоплазматичних везикул таких клітин знаходиться більше кон `югатів

ГS-Pt, ніж в чутливих клітинах [34]. Така внутрішньоклітінна компартменталізація ліків та продуктів їх метаболізму також вважається одним з механізмів лікарської резистентності. В багатьох випадках резистентні пухлинні клітини відрізняються розвинутою везикулярне сіткою, що дозволяє їм просторово нейтралізувати токсини та виводити їх шляхом екзоцітозу.

В експериментах з використанням бутіонінсульфоксіміна (BSO), інгібітора синтезу глутатіона, було показано, що при вітощенні внутрішньоклітінного глутатіона активність ГS-Х-помпи лише трохи зменшується [35]. Таким чином, ефективність транспорту ГS-Pt-кон `югатів визначається не тільки концентрацією останніх, а й експресією переносника.

Останнім часом з` явилися роботи, що засвідчують, що білок, асоційований з загальною лікарською резистентністю (MRP але не Pgp) може функціонувати як ГS-Х-помпа [36,37]. Ця гіпотеза підтверджується такими фактами: 1) клітини, що гіперекспресують MRP секретують у культуральні середовище більше глутатіона; 2) вітощення внутрішньоклітінного глутатіона за допомогою BSO запобігає виведенню ліків з клітин за допомогою MRP; 3) гіперекспресія MRP відповідає підсіленому АТФ-залежних транспорту кон `югатів ГS-Х; 4) антитіла до

MRP реагують з білком з молекулярною масою 190 кд, який може зв `язуватись з ГS-кон` югатамі та лейкотрієном С4.

Таким чином, видалення з клітин комплексів глутатіон-S-платина переносниками з активністю ГS-Х-помпи є важливим механізмом резистентності, завдяки якому внутрішньоклітінна концентрація препарату підтримується на низькому рівні, що сприяє зменшенню його пошкоджуючих ефекту.

4.2.Внутрішньоклітінні тіолові детоксікуючі системи

4.2.1. Система глутатіона

глутатіон та ферменти його метаболізму є важливими елементами меxанізму резистентності клітин до алкілуючіх агентів, в тому числі сполук платини.

Більшість клітинних ліній, резистентних до дії цисплатину відрізняються підвищеним вмістом внутрішньоклітінного глутатіона та/чи гіпреактівністю ферменту, що ініціює синтез глутатіона? - глутамілцістеінсінтетазі (?-ГЦС) [38-40]. Однак описані приклади стійких до дії цисплатину клітинних ліній з нормальним [41,42] та зниженим [43] у порівнянні з чутливими лініями вмістом глутатіона.

Сучасні стереоскопічні та спректроскопічні методи дозволили визначити, що глутатіон та цисплатин реагують безпосередньо у безклітінній системі в молярній співвідношенні 2/1, утворюючи хелатній комплекс діглутатіонплатіні. Після 12 годин інкубації клітин в середовищі з цисплатином концентрація ГS-Pt-кон `югатів стає максимальною. При цьому 60% внутрішньоклітинної платини знаходиться у зв `язаного стані [10].

Заслуговують на увагу дані, отримані в експериментах з використанням інгібітора синтезу глутатіона бутіонінсульфоксіміна

(BSO). Обробка BSO клітинних ліній раку шлунка людини MKN-28 та MKN-

45, раку яєчника КК та МН, аденокарцинома ротової порожнини КВ призводить до сенсибілізації клітин до дії цисплатину [44,45]. < p> Причому вітощення внутрішньоклітінного глутатіона за допомогою BSO не впливали на акумулювання цисплатину в клітинах а також формування кон `югатів GSH-Pt [46].

При вівчeнні взаємодії ферментів метаболізму глутатіона та їх ролі в механізмах резистентності велике значення мають експерименти з використанням культур клітин, трансфекованіх генами відповідних ензімів. Наприклад, клітини раку легенів людини, трансфековані геном ферменту?-ГЦС, мають у 2 рази більше глутатіона, в 1,6 рази підвищену активність ГS-Х-помпи та в 1,5 рази меньшу акумуляцію цисплатину, в 6,7 рази більшу резистентність до цисплатину у порівнянні з батьківською клітинною лінією. Вітощення внутрішньоклітінного глутатіона в трансфектах за допомогою BSO не впливали на резистентність до цисплатину. У таких випадках зберіглась висока активність ГS-X-помпи і тому внутрішньоклітінна концентрація платини не змінилася. Таким чином, в даній клітинній системі резистентність обумовлена посиленим видаленням ГS-Pt-конюгатів за допомогою ГS-Х-помпи, що не загубила своєї активності навіть при вітощенні субстрату (глутатіона) [47].

В той же час не винайдено ніякого зв `язку між рівнем експресії глутатіонредуктазі та глутатіонпероксидази та ступенем стійкості клітин до дії цисплатину [48,49].

4.2.2.Металотеонеіні

Особлива роль у формуванні резистентності відводиться металотеонеінам.

Оскільки у вільному стані ці сполуки нуклеофільні, металотеонеіні зв `язуються з електрофільнімі протипухлинними препаратами типу цисплатину, а також мелфаланом та деякими антибіотиками: адріаміціном, блеоміціном та доксорубіціном.

Клітини , що гіперексперсують металотеонеіні, часто резистентні до дії цисплатину [50,51]. Однак металотеонеін не є обов `язковим компонентом резистентності до цього препарату, оскільки зустрічаються резистентні до цисплатину клітинні лінії, в яких металотеонеін не виявляється [43].

При обробці цисплатином резистентних до препарату клітин з підвищеним вмістом металотеонеіна 70% внутрішньоклітинної платини знаходять у зв `язаного з білком стані.

Досліди по трансфекції гена металотеонеіна ІІА показали, що клітини-трансфекті набувають резистентності до цисплатину, хлорамбуцил та мелфалану [52].

Добре виражена експресія металотеонеіна в пухлинах може мати прогностичне значення. Наприклад, при лікування хворих на рак стравоходу за допомогою цисплатину 5-річна життєздатність пацієнтів з металотеонеін-від `ємними пухлинами становить 56%, а пацієнтів з металотеонеін-позитивними пухлинами - 26% [53].

З наведених вище даних можна заключити, що у випадках підвищеної експресії металотеонеін є важливою складовою резистентності до цисплатину.

4.3.Репарація пошкоджень ДНК.

резистентність клітин до дії цисплатину може залежати від стану системи репарації пошкоджень ДНК.

Один з механізмів резистентності клітин до цисплатину - прискорена репарація цисплатин-ДНК-адуктів [54]. Чутливі до дії цисплатину клітинні лінії відрізняються зниженою здатністю ліквідувати основні адукті ДНК та цисплатину (GG-Pt та GA-Pt), а також послабленню активністю ДНК-полімераз [55,56]. О?? боязко резистентних до цисплатину клітин афідікоіном - інгібітором ДНК-полімераз? та? повертає чутливість до цисплатину, що стверджує роль репарації адуктів цисплатин-ДНК у формуванні резистентності

[57].

На сьогодні мало відомо, щодо ліквідації продуктів платінування

ДНК у мітохондріях. Вважають, що мітохондріальна ендонуклеаза G (Endo

G) може брати участь у репаративних процесах цих органел [58].

Нещодавно з культуральної рідини пухлинних клітин та біопсійного матеріалу пухлин людини були виділені білки HMG (high-mobility group) та їм подібні, які зв `язуються з ДНК, що пошкоджена цисплатином, але не трансплатіном чи ультрафіолетовим віпроміненням

[59,60]. Ці білки - вісококонсерватівні, локалізуються у цитоплазмі та ядрі клітини. Їх біологічна роль ще точно не встановлена.

Інтенсивність зв `язування ДНК з цисплатином та HMG-подібними білками прямо пропорційна ступеню пошкодження ДНК. ДНК резистентних клітин зв `язується з цими білками більш ефективно. HMG-білки взаємодіють з платінованою ДНК, закривають пошкоджені сайти від ферментів ексцізійної репарації. Припускають, що зв `язування HMG-подібних білків з пошкодженою ДНК може викликати зупинку реплікації чи транскрипції, а також впливати на роботу систем контролю клітинного циклу при руйнуванні ДНК.

Відомо, що такі дефекти системи репарації невідповідностей

(mismatch repair), як недостатня експресія білків hMSH2 чи hMLH-1, призводять до виникнення резистентності до цисплатину [61,62]. MSH2-білок сам по собі чи разом з білком GTBP/p160 розпізнає невеликі зміни у ланцюгу ДНК, наприклад, продукти платінування ДНК, і зв `язується з ними.

Апріорі можна було б припустити, що відсутність якої - небудь частини системи репарації ДНК сприяє розвитку гіперчутливості до дії цисплатину, що відбувається у клітинах, дефектних за системою ексцізійної репарації. Але у випадку порушення функції системи mismatch repair клітина набуває резистентності до цисплатину. Цей феномен можна розглядати з двох позицій. По-перше, порушення системи mismatch repair може бути наслідком індукованого цисплатином випадкового мутагенезу, що в результаті обумовлює стійкість до дії цисплатину. По-друге, саме дефект у роботі цієї системи репарації може покласти початок резистентності [63,64].

Комплекс білків репарації "розпізнає" адукті у ланцюгу-шаблоні

ДНК та намагається виправити ланцюг, що синтезується [65]. Так, поки існує адукт у ланцюгу-шаблоні, а підбір нових основі не ліквідує невідповідність, що існує, генерується сигнал, який запускає програму апоптозу. Якщо система mismatch repair не працює, такий сигнал не генерується, клітини стають толерантними до адуктів цисплатин-ДНК та набувають резистентного фенотипу.

У випадку порушення системи ексцізійної репарації спостерігається протилежний ефект. Клітини, дефектні по системі ексцізійної репарації значно більш чутливі до дії цисплатину, ніж нормальні клітини [66].

Показано, що цисплатин індукує експресію важливого для ексцізійної репарації гена ERCC-1. Але до активації гена ERCC-1 відбувається активації генів c-fos та c-jun, а також фосфорилювання білка c-Jun [67].

Нещодавно був відкритий новий ген BRCA1, повязаний з репарацією пошкодженої ДНК. Показано, що гіперекспресія цього гена в клітинах раку яєчника та молочної залози асоційована з резистентністю до дії цисплатину [68].

Топоізомеразі І та ІІ, що релаксують спіралі ДНК, є важливими ферментами реплікації, транскрипції та рекомбінації. Вони відіграють суттєву роль у процесах усунення адуктів ДНК-цисплатин. У багатьох резистентних до дії цисплатину клітинах спостерігається підвищена активність топоізомеразі ІІ [69]. Інгібітори топоізомераз І та ІІ: етопозід, камтотецін, СРТ-11, SN-38, новобіоцін - викликають сенсібілізацію резистентних клітин до дії цисплатину [70-72].

Ще одним механізмом резистентності до цисплатину на рівні ДНК може бути підвищена концентрація в клітині вільних нуклеотидів

(наприклад, АТФ, АДФ), які конкурують з ДНК за зв `язування з цисплатином [73]. Таким чином, вільні нуклеотиди, концентрація яких у цитоплазмі відрізняється в різних клітинах, можуть значно впливати на чутливість пухлин до цисплатину.

Важливо також розглянути утворення зшівок ДНК-білок під дією цисплатину. Хоча кількість цих адуктів набагато менше, ніж у разі між-та внутрішньо-ланцюгових зшівок, але відмічено, що вони також відповідальні за цитотоксичних ефект цисплатину. Наприклад, було показано, що одна резистентна до дії цисплатину клітинна лінія раку яєчника утримувала у 6 разів менше цитокератину 18, ніж чутлива лінія. Трансфекція Комплементарна ДНК цитокератину 18 в клітини резістентної лінії давала клони з підвищеним рівнем цього білка та у більшості випадків з чутливим фенотипом. При цьому було встановлено, що після обробки цисплатином, з ДНК у клітинах зв `язуються негістонові білки. Пізніше ці білки було ідентифіковано як цитокератину [74]. Можливо, що формування зшівок цитокератин-ДНК, асоціюється з цітотоксічністю цисплатину. Тоді зменшення продукції цитокератину 18 у резистентних клітинах веде до зменшення кількості зшівок білок-ДНК та, як наслідок, зниження чутливості до цисплатину.

Виходячи з вищенаведеного, можна заключити, що резистентність до дії цисплатину на рівні ДНК обумовлена підвищеною активністю систем репарації клітини чи її толерантністю до існуючих ДНК-Pt-адуктів.

4.4.Зміні генома, що асоційовані з резистентністю до цисплатіна.

Оскільки клітинна резистентність є стійко спадковою ознакою в ряду поколінь, можна зробити висновок, що стійкість до дії цисплатину визначається генетичними особливостями клітини.

Встановлено, що основна роль в цьому феномені належить 11-й та

16-й хромосомам у людини [ 75]. На клітинних гібрідах з різним хромосомному складом було показано, що обовязковою умовою резистентного фенотипу є наявність 16-ї хромосоми з резистентних клітин та 11-ї хромосоми з чутливих клітин. При цьому основну роль грає 16-та хромосома, а 11-та хромосома необхідна для її нормального функціонування. Ці хромосоми залучені у різні боки резистентності. На

16-тій хромосомі присутні гени MRP (multidrug resistance associated protein), LRP (lung resistance protein), гени додаткового білка ексцізійної репарації-4, металотеонеіна. На 11-їй хромосомі розташовані гени, що кодують глутатіон трансферазу? (ГSТ-?), А також протеін, що розпізнає специфічні послідовності пошкодженої ДНК.

Чутливість пухлинних клітин до дії цисплатину може залежати від функціональної активності генів р 53 та генів родини bcl.

На сьогодні все ще залишається відкритим питання про зв `язок лікарської резистентності з р 53-статусом клітин. Невизначеність тут існує тому, що роль білка Р 53 у хемочутлівості клітин до лікарської терапії розглядають з двох протилежних точок зору: 1) експресія білка

Р 53 дикого типу (wt p 53) збільшує чутливість до хіміотерапії шляхом прискорення входження клітин в апоптоз; 2) білок wt P 53 зменшує хемочутлівість, оскільки після пошкодження ДНК обумовлює зупинку росту для репарації ДНК [76].

Відомо, що після дії цисплатину у чутливих клітинах збільшується рівень експресії гена р 53 та відповідно - білка Р 53. Р

53 індукує експресію білка р 21/WAF1/CIP1-інгібітора ціклін залежних кіназ, що грає важливу роль у зупинці клітинного циклу у G1-фазі після генотоксичності стресу [77,78]. Під час цієї зупинки клітиною приймається "рішення": репаруваті ДНК чи входити в апоптоз, в залежності від глибини пошкодження. На сьогодні ще невідомі усі біохімічні подробиці того, як активація р 53 ініціює апоптоз.

Більшість робіт по вивченню функціональної активності Р 53 у резистентних до дії цисплатину клітинах засвідчують, що мутації гена р 53 призводять до розвитку резистентності до хіміотерапії [79-82].

Показано, що в резистентних клітинах часто порушена внутрішньоклітінна локалізація білка Р 53 [83] а також не відбувається індукція експресії Р 53 та р 21 цисплатином [84,85].

Досліди по трансфекції гена р 53 також довели, що перенос у дефектні за функцією Р 53 чи null-клітини wt p53-гена обумовлює збільшення чутливості до лікарських препаратів, а трансфекція мутантного гена mut p 53 спричиняє розвиток резистентності [86].

Досліджено, що в клітині після дії цисплатину разом з р 53 індукується експресія гена mdm 2. Продукт даного гена відрізняється властивістю утворювати комплекси з білком Р 53, таким чином дезактівуючі частину внутрішньоклітінного Р 53. У резистентних до цисплатину клітинах іноді спостерігається гіперекспресія гена mdm 2

[87] а використання антісмісловіх (проти mdm 2) нуклеотидів у такій системі призводить до збільшення чутливості до лікарської терапії

[88] .

Таким чином, функція Р 53 може бути інактивована двома шляхами: мутаціямі безпосередньо гена р 53 а також підвищеним комплексоутворення Р 53 з MDM 2.

Але дані деяких досліджень заперечують, що мутації р 53 обов `язково спричиняють розвиток лікарської резистентності. Feudis з співавторами показали, наприклад, на 9 клітинних лініях раку яєчника з різним р 53 - статусом, що в цих клітинних лініях після обробки цисплатином рівень експерсії р 21 підвищується однаковo і немає різниці у чутливості до апоптозу, індукованого дією препарату < p> [89,90].

Однак відомо, що більш половини злоякісних новоутворень людини відрізняються мутаціямі р 53, i ця ознака є важливим показником чутливості пухлин до хіміотерапії [91]. У клінічних дослідженнях показано, що рівень експресії р 53 у зразках біопсійного матеріала при раку шлунка та яєчників може бути важливим прогностичний показником захворювання [92]. Досліджено, що Р 53-позитивний фенотип пухлин асоціюється з поганим прогнозом [93,94]. Це пояснюється тим, що мутантна форма білка має подовшеній час напівжіття і тому легше виявляється імуногістохімічно.

Білки родини Bcl (Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-Xs, Bax та інші) грають важливу роль у регуляції процесу апоптозу. Деякі з них (Bcl-Xl, Bcl-

2) гальмують розвиток апоптоза, тоді як інші (Bcl-Xs, Bax, Bak) - навпаки є промоторами цього процесу. Відомо, що білки даної родини здатні гетеродімерізуватісь, утворюючи умовний "реостат", який регулює функціональну активність білків [95]. Досліджено, що білки

Bcl-2 та Bcl-Xl гіперекспресовані неопластичних при багатьох захворюваннях людини. Причому така гіпрекспресія асоційована з резистентністю пухлинних клітин in vitro до протипухлинних препаратів

[96]. Така стійкість клітин пов `язана з порушенням механізмів індукції апоптозу у відповідь на лікарську терапію. У дослідах з використанням клітин траксфекованіх генами bcl-2 чи bcl-xl було показано, що трансфекті набувають резистентної фенотип до цілого ряду лікарськії препаратів включаючи цисплатин [97,98]. У таких модельних клітинах була значно зменшена деградація ДНК після обробки цисплатином. Якщо порівнювати внесок продуктів генів bcl-2 та bcl-xl у антіапоптозному ефекті, то показано, що білок Bcl-Xl має більший вплив [99].

Після обробки цисплатином у чутливих клітинах, що входять в апоптоз, не змінюється рівень експресії білків Bcl-2, Bcl-Xl та Bax

(24kDa), але підвищується рівень білків Bak та Bax (21 kDa), тобто білків-агоністів апоптозау [100-102]. Відомо, що в деяких резистентних до цисплатину клітинних лініях спостерігається знижений рівень експресії Bax [103], а трансфекція гена bax спричиняє підвищення чутливості до хіміотерапії [104]. А от клітини з підвищеною експресією Bak відрізняються більшою чутливістю до дії цисплатину [105].
Відомо, що білок Bcl-2 часто гіперекспресованій у пухлинах людини. Причиноютакої гіперекспресії вважають часті ділеції великих нетрансльованіхпослідовностей з 3 та 5 - кінців гену bcl-2 (78-А). Дещо суперечливі дані імуногістохімічніх досліджень експресії білків родини Bcl у зразках біопсійного матеріалу та прогнозування чутливості до лікарської терапії у порівнянні з дослідженнями in vivo. Наприклад, одні дослідники повідомляють, що Вcl-2-позитивні неоплазії мають слабку відповідь на хіміотерапію та поганий прогноз [106,107], інші - навпаки, спостерігають, що експресія Вcl-2 у пухлинах асоціюється з покращеним виживанням [108]. Експресія Вax окремо не має ніякого прогностичне значення [109].

Роботи, зроблені з використанням резистентних до дії цисплатину лініях клітин показали важливість онкогена fos в резистентності до цього препарату. В резистентних лініях клітин спостерігали підвищений рівень експресії гена fos. Були визначені дві важливі функції Fos-білка: транскріпційна активація синтезу ДНК та участь у клітнінній проліферації. Fos-білок контролює клітинну відповідь на пошкодження

ДНК цисплатином через активацію генів топоізомеразі І, полімерази? та металотеонеіна [2].

Повідомляється про те, що гіперекспресія супресорного гена nm

23 супроводжується, як правило, збільшенням чутливості до дії цисплатину. Дані результати отримано з досліджень in vitro на клітинних лініях карциноми молочної залози людини MDA-MB-435, лінії карциноми яєчника OKAR-3 та лінії меланоми К-1735-ТК, а також при дослідженні клінічного матеріалу пухлин молочної залози. У всіх досліджуваних системах гіперекспресія nm 23 призвела до формування у клітинах великої кількості міжланцюговіх зшівок ДНК та збільшення чутливості до цисплатину [110].

Цікавими є дані по переносу резісткнтного до цисплатину фенотипу при трансфекції генів v-src. Непухлінні епітеліальні клітини людини HAG-1 після трансфекції гену v-src набували неопластичних фенотипу та резистентності до цисплатину. У трансформованих клітинах спостерігали значне зменьшення формування міжланцюговіх зшівок ДНК з їх послідовним швидким видаленням. Після обробки даних клітин інгібіторамі src-кіназ знижувався рівень резистентності до цисплатину. Результати цієї роботи вказують на можливість участі продукту гена v-src в індукції резітентності до цисплатину шляхом модуляції деяких шляхів репарації ДНК [111].

Ампліфікація гена сорціна (кальцій-звязуючого білка з молекулярною масою 19-22кД) в деяких модельних системах асоціювалася з резистентних фенотипом [112]. Важко зараз сказати, чи є резистентність пов `язаною саме з сорціном чи разом з геном сорціна у клітинах ампліфіковані і інші, більш важливі для розвитку резистентності гени.

Таким чином резистентність до цисплатину має комплексний характер і пов` язана з рядом особливостей клітин на рівні цитоплазматичної мемрані, внутрішньоклітінніх систем детоксикації, систем репарації та порушення функціональної активності генів p 53, bcl-2, fos, mdm 2, nm23та інших.

Список літератури

1. Чехун ВФ. Роль плазматичних мембран нормальних і пухлинних клітин в механізмі реалізації цитотоксичних ефектів координаційних сполук платини [Автореф дис ... докт мед наук]. Київ: ІЕПОР, 1994. 40 сс.

2. Scanlon KJ, Kashani-Sabet M, Tone T, Funato T. Cisplatin resistance in human cancers. Pharmacol Ther 1991; 52:385-406.

3. Gately DP, S. B. Howell SB. Cellular accumulation of the anticancer agent cisplatin. Br J Cancer 1993; 67:1171-6.

4. Ohmori T, Morikage T. The mechanism of the difference in cellular uptake of platinum derivatives in non-small cell lung cancer cell line (PC-14) and its cisplatin-resistant subline (PC-14/CDDP). Jpn J

Cancer Res 1993; 84: 83-92.

5. Scanlon KJ, Safistein RL, Thies H, Gross RB, Waxman S, Guttenplan

JB. Inhibition of amino acid transport by cis-diamminedichloroplatinum (II) derivatives in L1210 murine leukemia cells. Cancer Res 1983, 43: 4211-5.

6. Andrews PA, Velury S, Mann SC, Howell SB. Cis-diamminedichloroplatinum II accumulation in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cells. Cancer Res 1988; 48: 68-73.

7. Richon VM, Schulte N, Eastman A. Multiple mechanisms of resistance to cis-diamminedichloroplatinum (II) in murine leukemia

L1210 cells. Cancer Res 1987 47: 2056-61.

8. Zaman GJR, Lakelma J, Tellingen O, Beijnen J, Dekker H,

Paulusma C, Oude Elferink RPJ, Baas F, Borst P. Role of glutathione in the export of compaunds from cells by the multidrug-resistance-associated protein. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:7690-4.

9. Muller V, Meijer C, Zaman GJR. Overexpression of the gene encoding the multidrug resistance-assiciated protein results in increased ATP-dependent glutathione S-conjugate transport. Proc Natl Acad Sci USA

1994; 91: 13033-7.

10. Ishikawa T, Ali-Osman F. Glutathione-associated cis-diamminedichloroplatinum (II) metabolism and ATP-dependent efflux from leukemia cells. J Biol Chem 1993; 268: 20116-25.

11. Laurent G, Erickson LC, Sharkey NA, Kohn KW. DNA cross-linking and cytotoxicity induced by cis-diamminedichloroplatinum (II) in human normal and tumor cell lines. Cancer Res 1981; 41: 3347-51.

12. Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of events associated with cell cycle arrest at G2 phase and cell death induced by cisplatin. J Natl Cancer Inst 1990; 82: 749-55.

13. Olivero OA, Chang PK, Lopez-larraza DM, Semino-Mora MC, Poirier

MC. Preferential formation and decreased removal of cisplatin-DNA adducts in chinese hamster ovary cell mitochondrial DNA as compared to nuclear DNA. Mutat Res 1997, 391 (1-2): 79-86.

14. Giurgiovich AJ, Diwan BA, Olivero OA, Anderson LM, Rice JM,

Poirier MC. Elevated mitochondrial cisplatin-DNA adduct levels in rat tissues after transplacental cisplatin exposure. Carcinogenesis 1997,

18 (1): 93-6.

15. Gorczyca W, Gong I, Ardelt B, Traganos F, Darzynkiewicz Z. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Res 1993,

53 (13): 3186-92.

16. el Alaoui S, Lawry J, Griffin M. The cell cycle and induction of apoptosis in a hamster fibrosarcoma cell line treated with anticancer drugs: its importance to solid tumor chemotherapy. J Neurooncol 1997,

31 (1-2): 195-207.

17. Vaisman A, Varchenko M, Said I, Chaney SG. Cell cycle changes associated with formation of Pt-DNA adducts in human ovarian carcinoma cells with different cisplatin sensitivity. Cytometry 1997,

27 (1): 54-64.

18. Nishio K, Saigo N. Effect of cisplatin on cell cycle regulators.

Gan To Kagaku Ryoho 1994, 21 (3): 289-94.

19. Dimanche-Boitrel MT, Micheau O, Hamman A, Haugg M, Eymin B,

Chauffert B, Solary E. Contribution of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIP1 to the confluence-dependent resistance of HT 29 human colon carcinoma cells. Int J Cancer 1998, 77 (5): 796-802.

20. Gill JS, Mindebank AJ. Cisplatin-induced apoptosis in rat dorsal root ganglion neurons is associated with attempted entry into the cell cycle. J Clin Invest 1998, 101 (12): 2842-50.

21. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM. Induction of p 21

WAF1? CIP1/SDI1 in kidney tubule cells affects the course of cisplatin-induced acute renal failure. J Clin Invest 1998, 101 (4): 777-82.

22. Otto AM, Paddenberg R, Schubert S, Mannherz HG. Cell cycle arrest, micronucleus formation, and cell death in growth inhibition of MCF-7 breast cancer cells by tamoxifen and cisplatin. J Cancer Res

Clin Oncol 1996, 122 (10): 603-612.

23. Boersma AW, Nooter K, Oostrum RG, Stoter G. Quantification of apoptotic cells with fluorescein isothiocyanate-labeled annexin V in chinese hamster ovary cells cultures treated with cisplatin.

Cytometry 1996, 24 (2): 123-130.

24. Ormerod MG, O `Neill C, Robertson D, Helland LR, Harrap KR. Cis-diamminedichloroplatinum (II)-induced cell death through apoptosis in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cell lines. Cancer

Chemother Pharmacol 1996, 37 (5): 463-471.

25. Uslu R, Jewett A, Bonavida B. Sensitization of human ovarian tumor cells by subtoxic CDDP to anti-fas antibody mediated cytotoxicity and apoptosis. Gynecol Oncol 1996, 62 (2): 282-91.

26. Fulda S, Sieverts H, Friesen C, Herr I, Debatin KM. The CD95 (APO-

1/Fas) system mediates drug-induced apoptosis in neuroblastoma cells.

Cancer Res 1997, 57 (17): 3823-9.

27. McGahon AJ, Costa Pereira AP, Daly L, Cotter TG. Chemotherapeutic drug-induced apoptosis in human leukaemic cells is independent of the

Fas (APO-1/CD95) receptor/ligand system. Br J Haematol 1998, 101 (3):

539-47.

28. Antoku K, Liu Z, Johnson DE. Inhibition of caspase proteases by

CrmA enhances the resistance of human leukemia cells to multiple chemotherapeutic agents. Leukemia 1997, 11 (10): 1665-72.

29. Chen Z, Naito M, Mashima T, Tsuruo T. Activation of actin-cleavable interleukin 1 beta-converting enzyme (ICE) family protease

CPP-32 during chemotherapeutic agent-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells. Cancer Res 1996, 56 (22): 5224-9.

30. Marissen WE, Lloyd RE. Eukariotic translation initiation factor

4G is targeted for proteolytic cleavage by caspase 3 during inhibition of translation in apoptotic cells. Mol Cell Biol 1998,

18 (12): 7565-74.

31. Kraker AJ, Moore CW. Accumulation of cis-diamminedichloroplatinum

(II) and platinum analogues by platinum-resistant murine leukemia cells in vitro. Cancer Res 1988; 48: 9-13.

32. Eichholtz-Wirth H, Hietel B. The relationship between cisplatin sensitivity and drug uptake into mammalian cells in vitro. Br J

Cancer 1986; 54: 239-43.

33. Kawai K, Kamatani N, Georges E, Ling V. Identification of a membrane glycoprotein overexpression in murine lymphoma sublines resistant to cis-diamminedichloroplatinum (II). J Biol Chem 1990;

265: 13137-42.

34. Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka H. GS-X pump Is functionally overexpressed in cis-diamminedichloroplatinum (II)-resistant human leukemia HL-60 Cells and downregulated by cell differentiation. J

Biol Chem 1994; 269: 29085-93.

35. Goto S, Yoshido K, MoriKawa T, Urata Y, Suzuki K,. Kondo T.

Augmentation of transport for cisplatin-glutathione adduct in cisplatin-resistant cancer cells. Cancer Res 1995; 55: 4297-301.

36. Veneroni S, Zaffaroni N, Daidone MG, Benini E, Villa R,

Silvestrini R. Expression of P-glycoprotein and in vitro or in vivo resistance to doxorubicin and cisplatin in breast and ovarian cancers. Eur J Cancer 1994; 30A: 1002-7.

37. Jedlitschky G, Leier J, Buchholz U, Barnouin K, Kurz G, Keppler

D. Transport of glutathione, glucuronate, and sulfate conjugates by the MRP gene-encoded conjugate export pump. Cancer Res 1996; 56: 988 -

94.

38. Okuyama T, Maehara Y, Endo K, Baba H, Adachi Y, Kuwano M,

Sugimachi K. Expression of glutathione S-transferase-pi and sensitivity of human gastric cancer cells to cisplatin. Cancer 1994;

74: 1230-6.

39. Awasthi S, Sharma R, Singhal SS, Herzog NK, Chaubey M, Awasthi

YC. Modulation of cisplatin cytotoxicity by sulphasalazine. Br J

Cancer 1994; 70: 190-4.

40. Bongers V, Snow GB, Braakhuis BJM. The role of glutathione S-transferases in head and neck squamous cell carcinogenesis. Eur J

Cancer 1995; 31B: 349-54.

41 Minagawa Y, Kigawa J, Ishihara H, Itamochi H, Terakawa N.

Synergistic enhancement of cisplatin cytotoxicity by SN-38, an active metabolite of CPT-11, for cisplatin-resistant HeLa cells. Jpn J

Cancer Res 1994, 85: 966-71.

42. Boscia RE, Korbut T, Holden SA, Ara G, Teicher BA. Interaction of topoisomerase I inhibitors with radiation in cis-

Diamminedichloroplatinum (II)-sensitive and-resistant cells in vitro and in the FSAIIC fibrosarcoma in vivo. Int J Cancer 1993, 53: 118 -

23.

43. Kikuchi Y, Hirata J, Yamamoto K, Ishi K, Kita T, Kudoh K, Tode

T, Nagata I, Taniguchi K, Kuwano M. Altered expression of? - Glutamylcysteine synthetase, metallothionein and topoisomerase I or

II during acquisition of drug resistance to cisplatin in human ovarian cancer cells. Jpn J Cancer Res 1997; 88: 213-7.

44. Hirata J, Kikuchi Y, Kita T, Imaizumi EE, Tode T, Ishii K, Kudoh

K, Nagata I. Modulation o