Сьогодення та майбутнє біосенсори

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ТВЕРСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Факультет хіміко-біолого-географічний
Кафедра неорганічної та аналітичної хімії

Курсова робота

"Сьогодення та майбутнє біосенсори"

Твер - 2002р.

Зміст

Вступ 3
Що таке біосенсори 3
Як працює біосенсори 5
Де застосовують біосенсори 6
Біосенсори на основі інших біоматеріалів 7
Проблеми і перспективи розвитку 9
Література 11

Введення

Біологічні методи дозволяють судити про присутність якого-небудьречовини або його кількісний вміст За характером, розміром йоговпливу на певний організм, узятий як індикаторний.
Аналітичним сигналом при цьому є зміна станужиттєдіяльності цього організму, тобто його реакція на подразник,яким, наприклад, можуть бути токсиканти середовища проживання або які-небудьінші біологічно активні сполуки, які призводять до порушення життєвихіндикаторного функцій організму або його загибель. До біологічних методіввідносять і біохімічні методи, зокрема ферментативні, а такожрізні методики, наприклад індикаторні трубки на основі ферментів іінших біологічних матеріалів. Цікаво, що механізм одержанняінформації про склад якого-небудь об'єкта за допомогою цих методів і пристроївмоделює процес в живій природі, що особливо важливо при аналізі об'єктівбіологічного походження.

Відомо, що ферменти - це біологічні каталізатори, що володіютьяскраво вираженою здатністю вибірково каталізувати багато хімічнихперетворення як у живій клітині, так і поза організмом. Чудові властивостіферментів давно привертали увагу дослідників, у тому числі іаналітиків, але практичного застосування ферментів, наприклад дляаналітичних цілей, перешкоджали насамперед мала доступність чистихферментів, нестійкість в часі їх розчинів, препаратів при зберіганній вплив на них різних факторів (теплових, хімічних),неможливість багаторазового використання однієї порції ферменту черезскладності відділення його від інших компонентів розчину, висока вартістьочищених препаратів. Однак вихід з положення незабаром було знайдено, із'явилася можливість використання каталітичних властивостей ферментів поза нимизв'язку з живим організмом, і можливість збереження цієї здатності впротягом тривалого часу практично без зміни. Досягнення в ційгалузі біохімії і ензимології дали початок розвитку нового напрямкуаналітичної хімії - безреагентниє методів аналізу, заснованих навикористанні різних біохімічних сенсорів.

Що таке біосенсори

Під терміном "біосенсори" слід розуміти пристрій, у якомучутливий шар, що містить біологічний матеріал: ферменти, тканини,бактерії, дріжджі, антигени/антитіла, ліпосоми, органели, рецептори, ДНК,безпосередньо реагує на присутність визначається компонента,генерує сигнал, функціонально пов'язаний з концентрацією цьогокомпонента. Конструктивно біосенсори являє собою комбінованепристрій, що складається з двох перетворювачів, або трансд'юсером, --біохімічного і фізичного, що перебувають у тісному контакті один з одним.
Біохімічний перетворювач, або біотрансдьюсер, виконує функціюбіологічного елементу розпізнавання, перетворюючи обумовлений компонент, аточніше, інформацію про хімічні зв'язки в фізична або хімічна властивістьабо сигнал, а фізичний перетворювач це властивість фіксує за допомогоюспеціальної апаратури. В даному випадку реалізується принципово новийспосіб одержання інформації про хімічний склад розчину. Наявність упристрої біоматеріалу з унікальними властивостями дозволяє з високоюселективністю визначати потрібні з'єднання в складній по складу суміші, невдаючись до жодних додаткових операціях, пов'язаних з використаннямінших реагентів, концентрування і т. д. (звідси і назва --безреагентниє методи аналізу).

Існує велика різноманітність фізичних трансд'юсером:електрохімічні, спектроскопічні, термічні, п'єзоелектричні,трансд'юсером на поверхневих акустичних хвилях і т.п. В даний часнайбільшого поширення набули електрохімічні перетворювачі. Одніз них генерують потенціал на спеціальному електроді, на поверхнюякого нанесений шар біоматеріалу, інші генерують електричний струмреакції продукту перетворення визначається речовини на поверхніелектроду, викликаного біоматеріалів. Іншими словами, існують потен -і амперометріческіе біосенсори. Якщо фізичний перетворювач використовуєзміна светопоглощенія в області біослоя, то такий біосенсори називається,наприклад, оптоволоконним, оскільки вимірюється сигнал буде передаватисявимірювального приладу з оптичного волокна. Відповідний фізичнийперетворювач за аналогією з електродом називають оптродом. За назвоюперетворювача можна зробити висновок про характер фізичного властивості,яке вимірюється апаратно, причому, як правило, при такому вимірівикористовується мікропроцесорна техніка, що дозволяє зробити пристрійдосить компактним.

Перша згадка про аналітичні пристроях на основі ферментів абоферментсодержащіх матеріалів з'явилося порівняно недавно, в 60-х рокахнашого сторіччя. Потім у побут увійшло поняття "біосенсори" або "біочипів". Цеважлива подія в науці. Тут відображаються глибокі причини, пов'язані з такзваними інтеграційно-синтетичними процесами в науці, що приводять допояви нових знань. Функціонально, таким чином, біосенсоризіставлені з датчиками живого організму - біорецепторамі, здатнимиперетворювати всі типи сигналів, що надходять з навколишнього середовища, велектричні.

Як працює біосенсори

Принцип роботи біосенсора досить простий. Визначається речовинадифундує через напівпроникну мембрану в тонкий шар біокаталізатора,в якому і протікає ферментативна реакція. Оскільки в даному випадкупродукт ферментативної реакції визначається за допомогою електроду, наповерхні якого закріплений фермент, то такий пристрій ще називаютьферментним електродом. Таким чином, визначення "біосенсори" і "ферментнийелектрод "в даному випадку синоніми.

Слід зазначити, що характер ферментативної реакції залежить відприроди ферменту, типу його каталітичної дії. Серед ферментів можнавиділити оксидоредуктаз, що здійснюють реакції окислення івідновлення, гідролази, каталізують гідроліз, трансферази, що викликаютьперенесення ацільних, глікозидних і т.п. залишків і т.д. Багато ферменти зараздоступні, їх чисті препарати включені в каталоги ряду фірм-виробників.
Важливо відзначити, що при конструюванні біосенсора збільшеннятривалості дії ферменту стає основним завданням. Річ уте, що нативний фермент зберігає свої властивості лише протягомвідносно короткий проміжок часу. Тому була розроблена операція такзваної іммобілізації ферменту. Під час іммобілізації за допомогоюспеціальних реагентів фермент "закріплюють" або на поверхні адсорбентів,силікагелю наприклад, вугілля або целюлози, або вводять у плівку пористогополімеру, або ковалентно, тобто за допомогою хімічних зв'язків, "пришивають"до якої-небудь підкладці. При цьому фермент закріплюється, перестає бутирухливим, не вимивається з біослоя, а його каталітичну діюзберігається .. Як видно, при іммобілізації ферментів використовуютьрізноманітні способи їхнього закріплення, у тому числі і комбіновані.
Біосенсори можуть бути сконструйовані і по так званої об'ємноїтехнології, при якій індивідуальні компоненти, що складають як би єдинийфізичний ансамбль. Хоча такі біосенсори в даний час і застосовуютьсяна практиці, вони мають недоліки, є труднощі і при їх виготовленні. УНасправді, шарове покриття електрода або якого-небудь твердогоперетворювача мембраною повинно бути відтворено. Відповіднатехнологія формування поверхні повинна допускати можливістьвиготовлення досить мініатюрного електрода. Крім того, біосенсори зпорівняно товстими мембранами дають у підсумку більший час відгуку,є складнощі і при їх градуювання. Прогрес у розвитку засобівмікроелектроніки підштовхнули розробників конструкцій біосенсори до новихрішень. Виявилося перспективним використовувати так звану планарнихтехнологію (фотолітографії, напівпровідникову техніку покриттів і т. д.), поякої можна виготовити так званий біочипів, що поєднує сенсорнусистему, трансд'юсером, аналого-цифровий перетворювач і мікропроцесор длявимірювання аналітичного сигналу і розрахунку результатів аналізу. Хоча такібіочипів можуть тиражуватися, основною проблемою в даному випадку будебути відтворюваність стану, тобто мікроструктури поверхні знанесеним шаром біологічно активного ферменту. Важкою завданнямпредставляється в даному випадку і оптимізація такої структури на відміну відоб'ємної технології, реалізованої присутністю в конструкції сенсорноїчастини декількох молекулярних шарів. Тим не менш "молекулярний дизайн" приконструюванні біосенсори майбутнього може скласти реальну конкуренціюоб'ємному їх варіанту.

Де застосовують біосенсори

Мабуть, найбільш поширеним в даний час єамперометріческій біосенсори на основі іммобілізованих глюкозоксідази длявизначення цукру в крові. Історично цей біосенсори є самим
"стародавнім". В даний час для визначення глюкози створено найбільшучисло різних біосенсори, що пов'язано з необхідністю контролю завмістом цукру в біологічних рідинах, наприклад в крові, придіагностуванні і лікуванні деяких захворювань, перш за все діабету.
Схема функціонування біосенсора на глюкозу в принципі типова й дляінших амперометріческіх біосенсори з аналогічним трансд'юсером. Токвідновлення кисню на платиновому катоді прямо пропорційнийконцентрації кисню. У присутності субстрату (наприклад, глюкози в крові,взятої для аналізу) ферментативна реакція знижує концентрацію O2.Такімчином, струм відновлення кисню зменшується пропорційноконцентрації субстрату

Перевага цього типу біосенсора полягає насамперед у йоговисокої селективності. Вибірковість подібних біосенсори визначаєтьсявисокою специфічністю глюкозоксідази і природою електрохімічної реакції,в якій беруть участь компоненти ферментативного процесу. У цілому класферментів - оксидаз є високоспецифічний по відношенню до визначенимсубстрату. Системи ж на основі небіологічного перетворювача,навпаки, не настільки селективно, як цього хотілося б, що обумовлено рядомпричин. Тим не менше є обмеження і по застосуванню даної конструкціїбіосенсора, обумовлені впливом кисню та інших сторонніх речовин,здатних проникати через біослой (точніше, через мембрану), а тому завданняудосконалення конструкцій біосенсори на глюкозу представляється вельмиактуальною.

Один з можливих шляхів такого вдосконалення полягає внаступному. Якщо змінити полярність включення електрода-трансд'юсером вглюкозних біосенсори на протилежну, тобто платиновий катод зробитианодом, то при потенціалі 0,6 В він стає абсолютно нечутливимдо кисню, але зате дає відгук на пероксид водню, який при даномузначенні потенціалу окислюється до води. Чутливість такого електрода допероксиду водню виявилася привабливою, а оскільки вода утворюєтьсяяк продукт ферментативної реакції, за його змістом можна зробити висновок проконцентрації, наприклад глюкози в різних об'єктах. Інший спосібпокращення селективності біосенсори та усунення перешкод від сторонніхдомішок полягає у використанні різних мембран - плівок,запобігають їх попадання безпосередньо на електрод-перетворювач.
При цьому внутрішня мембрана виконує функцію захисту від домішок, азовнішня мембрана пропускає субстрат в біослой. Однак необхідно відзначити,що за допомогою спеціальних прийомів, званих хімічною модифікацією,можна настільки змінити властивості поверхні електрода, що вінбуде "глухою" до більшості домішок і, навпаки, чутливим докомпонентів ферментативної реакції.

біосенсори, засновані на кисневому електроді як фізичномутрансд'юсером, дозволяють визначати різноманітні субстрати ферментів: крімглюкози - лактати, L-амінокислоти, саліцилати, оксалати, піруват, тобтоаніони відповідних карбонових кислот. У літературі описані іншібіосенсори подібного типу, ряд яких застосовується на практиці.

За допомогою біосенсори можна вирішити і зворотну задачу: при деякійпевної концентрації субстрату оцінювати активність власнеферменту за величиною вимірюваного сигналу (потенціалу, струму і т. д.). Зопису роботи ферменту випливає, що вимірюється сигнал залежить не тількивід концентрації субстрату, але й від каталітичної активності біологічногоперетворювача, тобто ферменту. Таке використання біосенсоридозволяє виміряти активність великої кількості ферментів, наприклад в крові.
Оцінка активності ферментів, пов'язаних із серцевою діяльністю, таких,як аспартамамінотрансфераза, Креатинкіназа, дозволяє в клінічнихумовах оцінювати глибину інфаркту міокарда. Вимірювання активності ферментуамілази використовуються в педіатрії.

біосенсори на основі інших біоматеріалів

Багато ферменти дороги і швидко втрачають свою активність, використаннявиконаних на їх основі біосенсори не може бути економічнодоцільним. Тому застосування бактерій, мікроорганізмів ібіологічних тканин різного походження більш переважно,оскільки в цьому випадку відпадає необхідність у попередньомуотриманні і очищення ферментів. До істотних недоліків таких біосенсориможна віднести низьку селективність визначення внаслідок того, що клітиниживих організмів фактично є джерелом найрізноманітнішихферментів. Крім цього час відгуку біосенсори на основі тканин імікроорганізмів може бути достатньо великим, що також зменшує їхпрактичну цінність. Проте останнім часом спостерігаєтьсяпідвищений інтерес до розробки конструкцій електродів, що містять не саміферменти в очищеному вигляді, а їх первісні джерела - біологічніматеріали. Так, було встановлено, що тканинні зрізи в біосенсори можутьвиконувати функцію джерел каталітичної активності. Наприклад, створенийбіосенсори на аскорбінову кислоту, що складається з платинового електрода іпластини шкірки огірка або гарбуза, що служить джерелом аскорбіноксідази.
Активність ферменту в такій природного матриці достатня для проведення 50 -
80 визначень аскорбінової кислоти в різних об'єктах. Встановлено, щопластини біоматеріалу можуть зберігатися без втрати активності протягом рокув 50%-ном гліцерині.

Аналогічний підхід використовували при створенні конструкції біосенсора надопамін - найважливіший біогенний амін, що бере участь у регуляції діяльностімозку. У даному біосенсори тканина плоду банана була іммобілізованих наповерхні кисневого електроду. У розглянутих випадках біоматеріалистворюють "природне оточення" для ферментів, що сприяє стабілізаціїїх активності. Тканинні матеріали досить довго зберігають високуспецифічність, що дуже важливо для біосенсора, тоді як виділеніферменти в тих же умовах швидко руйнуються. Відомі біосенсори, вяких використано цілісний фрагмент тканини печінки бика, що єносієм ферменту каталази і іммобілізованих на кисневому електроді.
Ферментативне дію каталази, що виявляється в каталізі реакціїрозкладання пероксиду водню, використовують у цьому випадку для створеннявідповідного електрода. Розроблено біосенсори на основі шкірки кабачкаабо огірка і кисневого електроду для визначення L-аскорбінової кислотиу фруктових соках, що функціонує подібно до аналогічного типу електрода,вже розглянутого вище. Проте, незважаючи на успіхи в розвиткубіосенсори на основі біологічних матеріалів, надійність їхфункціонування в?? е ще залишається спірною. Ще один приклад конструкціїбіосенсорні пристрої відноситься до ферментної електроду на основімікроорганізмів - дріжджів, які розміщені між двома пористими мембранами.
Біосенсори на основі іммобілізованих дріжджів і кисневого електродудозволяє визначати етанол і метанол, наприклад, у промислових стоках.

Інтерес представляють біосенсори на основі іммобілізованих на мембранімікроорганізмів, які служать елементом так званого мікробного сенсора. УЯк приклад таких пристроїв можна згадати амперометріческій сенсорна аміак (в стічних водах) на основі іммобілізованих нітріфіцірующіхбактерій і кисневого електрода. Такий біосенсори корисний при вирішенніпитань охорони навколишнього середовища, і зокрема при контролі ступеняочищення промислових стоків.

Можна відзначити також використання біосенсори на основі гідролаз --ферментів, які є каталізаторами гідролітичного розщепленнясубстратів. Ці біосенсори призначаються, як правило, для еколого -аналітичного контролю залишкових кількостей пестицидів класуфосфорорганічних сполук, а також для визначення деяких ОР. Якщопри гідролізі якого-небудь субстрату ферментом класу гідролаз утворюєтьсяелектрохімічних активне з'єднання, то, контролюючи змістостаннього, можна контролювати ферментативну реакцію так само, як упопередніх випадках. Однак у присутності речовин, що є інгібіторами,активність ферменту зменшується, що і виявляється по сигналу,реєструється електродом. Цікаво відзначити високу чутливістьтакого визначення: ефект зміни активності ферменту доступний длявимірювання вже при дії ультраследових кількостей інгібітора - на рівніпіко-і фемтограмм

Проблеми і перспективи розвитку

Концепція розпізнавання визначається речовини за допомогоюіммобілізованих біоматеріалу виявилася плідною. У підсумкудослідники придбали новий засіб, що дозволяє швидко отриматидостовірну інформацію про стан навколишнього середовища та здоров'я людини.
Деякі біосенсори вже набувають поширення для індивідуальноговикористання в домашніх аптечках (частіше за все для визначення цукру вкрові). Інтерес до біосенсори безперервно зростає. У 1996 році відбулисячотири великі міжнародні конференції з біосенсори.

Якщо мати на увазі все розмаїття ферментів, які присутні тащо діють в живому організмі і є потенційними біологічнимиперетворювачами, то слід зазначити, що існуюче сьогодні числоконструкцій біосенсори може бути збільшено у десятки і навіть сотні разів.
Біосенсори набувають поширення в біотехнології. Хоча тут ізустрічаються труднощі, пов'язані з невисокою термічною стійкістюзапропонованих пристроїв, що призводить до дезактивації біослоя, є підставивважати, що даний недолік буде незабаром подолана. Так,вважають, що для збільшення терміну служби біосенсори у зазначених вищеумовах можна використовувати ферменти, виділені з термофільних бактерій іодноклітинних водоростей - мікроорганізмів, стійких до дії високихтемператур. Певні труднощі є також проблемиградуювання біосенсори і надійності їх свідчень. Для покращення останньогопоказника, зокрема, пропонується використовувати мультисенсорних систему,що складається з ряду біочипів. Для отримання певної "ємності" надійнихданих здійснюється розрахунок необхідного числа таких датчиків. Однак уцілому так звані метрологічні характеристики біосенсори цілкомприйнятні. Відносне стандартне відхилення визначається концентраціїне вище 10-12%, при тому, що нижня межа визначених змістівдосягає 10-15 моль/л. Деякі біосенсори працюють за принципом так-ні,що цілком прийнятно, коли вирішується питання про присутність ультрамалихкількостей токсичних речовин в об'єктах навколишнього середовища. Якщообумовлені компоненти знаходяться у складній суміші або матриці або ж близькіза своїми властивостями, то при аналізі використовують хроматографічні методиподілу. Контроль за поділом здійснюють за допомогою системидетекторів на основі біосенсори. І тут отримані вражаючірезультати: розділяють і кількісно визначають оптичні активніізомери, різні цукри (лактозу, фруктозу, глюкозу і т.д.), складні уструктурі біологічно активні з'єднання і т.п.

Ось один з недавніх прикладів розробки біосенсори, заснованих навикористанні природного хеморецептори. Хеморецептори, узятий ізчутливих антен (органел) блакитного морського краба, був прикріплений доультрамікроелектроду, що вимірює потенціал. В результаті був виготовленийновий тип потенціометричного детектора, надзвичайно швидко реагуєна незначні зміни складу середовища, в яку він занурений. Сам блакитнийкраб дуже чутливий до слідами важких металів і живе тільки внайчистішої морській воді.

На черзі створення біосенсори, замінюють рецептори живихорганізмів, що дозволить створити "штучні органи" нюху і смаку, атакож застосувати зазначені розробки для можливо більш точної іінформативною діагностики ряду захворювань. Безсумнівно, що в найближчомумайбутньому в цій суміжній галузі біології та хімії слід очікувати новихвідкриттів.

Література

1. Біосенсори: основи та додатки/Под ред. Е. Тернера та ін М.: Мир,

1992. 614 с.

2. Будніков Г.К., Майстренко В.Н., Муріно Ю.І. Вольтамперометрія з модифікованими і ультрамікроелектродамі. М.: Наука, 1994. 239 с.

3. Будніков Г.К., Медянцева Е.П., Бабкіна С.С.// Успехи химии. 1991. Т.

60. С. 881.