Російський хіміко-технологічний університет ім. Д. І. Менделєєва

Кафедра промислової біотехнології

МЕТОДИЧНА РОБОТА

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ Активність ферментів

Виконала: студентка групи Е-35

Тімошкіна Е.А.

Викладач:

Мартімьянова Н.А.

Москва, 1996 г

ЗМІСТ

Властивості ферментів як біологічних каталізаторів. 1

Отримання ферментних препаратів. 4

Загальні методи визначення активності ферментів. 6

Методи визначення активності протеолітичних ферментів 11

Література 19

Властивості ферментів як біологічних каталізаторів.

Фермент - від лат. fermentum - закваска; знзім - від грец. Ен - всередині, зими - закваска.

Ферменти, або ензими, - це каталізатори білкової природи, що утворюються і функціонують у всіх живих організмах. Походження термінів пов'язане з тим, що спочатку ферментативні процеси були відкриті і вивчені в бродильному виробництві. У кожній клітці є сотні різних ферментів. З їх допомогою здійснюються багато хімічні реакції, які можуть з великою швидкістю йти при температурах, що підходять для даного організму, тобто в межах від 5 до 400 С. Щоб ці реакції з тією ж швидкістю протікали поза організмом, потрібні були б високі температури і різкі зміни деяких інших умов. Для клітини це означало б загибель, тому що вся робота клітини будується таким чином, щоб уникнути будь-яких скільки-небудь помітних змін в нормальних умовах її існування. Отже, ферменти можна визначити як біологічні каталізатори, тобто як речовини, що прискорюють реакції. Вони абсолютно необхідні, тому що без них реакції в клітинах протікали б занадто повільно і не могли підтримувати життя.

Сукупність біохімічних реакцій, каталізуються ферментами, становить сутність обміну речовин, що є відмінною рисою всіх живих організмів. Через ферментативний апарат, регуляцію його активності відбувається і регулювання швидкості метаболічних реакцій, їх спрямованості.

Будучи каталізаторами, ферменти мають ряд спільних з небіологічних каталізаторами властивостей:

1. Ферменти не входять до складу кінцевих продуктів реакції і виходять з неї, як правило, у початковому вигляді, тобто вони не витрачаються в процесі каталізу (в даний час доведено, що деякі ферменти наприкінці хімічної реакції піддаються модифікації і навіть розпаду, а не звільняються в незмінному вигляді, як стверджував Л. Міхаеліс).

2. Ферменти не можуть порушити ті реакції, перебіг яких суперечить законам термодинаміки, вони прискорюють тільки ті реакції, які можуть протікати і без них.

3. Ферменти не зміщують положення рівноваги, а лише прискорюють його досягнення.

Специфічні властивості:

1. Звичайно ж, за своїм хімічним будові всі ферменти є білками.

2. Ефективність ферментів набагато вище, ніж небіологічних каталізаторів (швидкість протікання реакції за участю ферменту вище на кілька порядків).

3. Ферменти мають вузькою специфічністю, вибірковість дії на субстрати, тобто на речовини, перетворення яких вони каталізують.

Висока специфічність ферментів обумовлена конформаційної і електростатичного комплементарність між молекулами субстрату та ферменту і унікальною структурою активного центру ферменту, що забезпечують "впізнавання", високу спорідненість і вибірковість протікання однієї якої-небудь реакції з тисячі інших хімічних реакцій, що здійснюються одночасно в живих клітинах.

Залежно від механізму дії розрізняють ферменти з відносною (або груповий) специфічністю і абсолютною специфічністю. Так, для дії деяких гідролітичних ферментів найбільше значення має тип хімічного зв'язку в молекулі субстрату.

Наприклад, пепсин розщеплює білки тваринного і рослинного походження, хоча вони можуть істотно відрізнятися один від одного як за хімічною будовою і амінокислотним складом, так і за фізико-хімічними властивостями. Однак пепсин не розщеплює вуглеводи або жири.

Пояснюється це тим, що місцем дії пепсину є пептидна-СО-

NH-зв'язок. Для дії ліпази, що каталізує гідроліз жирів на гліцерин та жирні кислоти, таким місцем є складноефірний зв'язок.

Аналогічної відносною специфічністю володіють також деякі внутрішньоклітинні ферменти, наприклад гексокінази, що каталізує у присутності АТФ фосфорилювання майже всіх гексоз, хоча одночасно в клітинах є специфічні для кожної гексози ферменти, які виконують таку ж фосфорилювання.

Абсолютною специфічністю дії називають здатність ферменту каталізувати перетворення тільки єдиного субстрату. Будь-які модифікації в структурі субстрату роблять його недоступними для дії ферменту.

Стереохімічна специфічність ферментів обумовлена існуванням оптично ізомерних L-і D-форм або геометричних (цис-і транс-) ізомерів хімічних речовин. "Так, відомі оксидази L-і D-амінокислот, хоча в природних білках виявлені тільки L-амінокислоти.

Кожен з видів оксидаз діє тільки на свій специфічний стереоізомер.

+ ЅО2

L-амінокислота a-кетокислот + NH3 + H2O оксидаза L-амінокислот

+ ЅО2

D-амінокислота a-кетокислот + NH3 + H2O оксидаза D-амінокислот

Наочним прикладом стереохімічні специфічності є бактеріальна аспартатдекарбоксілаза, що каталізує відщеплення СО2 тільки від L-аспаргіновой кислоти з перетворення її в L-аланін "[1].

4. Регулюємість ферментів як біокаталізаторів. "Через регуляцію ферментативного апарату здійснюється скоординованість всіх метаболічних процесів у часі і просторі, спрямоване на відтворення живої метер, підтримання сталості внутрішньоклітинного середовища, на пристосування до мінливих зовнішніх умов" [2].

5. Термолабільних ферментів. Швидкість хімічних реакцій залежить від температури, тому каталізуються ферментами реакції також чутливі до змін температури. Однак внаслідок білкової природи ферменту теплова денатурація при підвищенні температури буде знижувати ефективну концентрацію ферменту з відповідним зниженням швидкості реакції. Таким чином, термолабільних, або чутливість до підвищення температури є одним з характерних властивостей ферментів, що різко відрізняють їх від неорганічних каталізаторів. При 1000С майже всі ферменти втрачають свою активність (виняток становлять, очевидно, тільки один фермент м'язової тканини - міокіназа, яка витримує нагрівання до 1000С). При низьких температурах (00С та нижче) ферменти, як правило, не руйнуються, хоча активність їх падає майже до нуля. У всіх випадках має значення час дії відповідної температури. В даний час для пепсину, трипсину і ряду інших ферментів доведено існування прямої залежності між швидкістю інактивації ферменту і ступенем денатурації білка. На термолабільних ферментів певний вплив мають концентрація субстрату, рН середовища та інші чинники.

6. Залежність активності ферментів від рН середовища. Ферменти зазвичай найбільш активні в межах вузької зони концентрації водневих іонів, відповідної для тварин тканин в основному виробленим в процесі еволюції фізіологічним значенням рН середовища 6.0 - 8.0. рН-оптимум дії ферментів лежить в межах фізіологічних значень. Виняток становить пепсин, рН-оптимум якого дорівнює 2.0. Пояснюється це тим, що пепсин входить до складу шлункового соку, що містить вільну соляну кислоту, яка створює оптимальну кисле середовище для дії цього ферменту. З іншого боку, рН-оптимум аргінази лежить в сильно лужний зоні (близько 10.0); такого середовища немає в клітинах печінки, отже, in vivo аргінази функціонує, мабуть, не у своїй оптимальній зоні рН середовища. Вплив змін рН середовища на молекули ферменту полягає у впливі на стан і ступінь іонізації кислотних і основних груп (СООН-групи дикарбонових амінокислот, SH-групи цистеїну, імідазольного азоту гістидину та ін.) При різних значеннях рН середовища активний центр може знаходитися в частково іонізованою або в неіонізованій формі, що позначається на третинної структурі білка і відповідно формування активного фермент-субстратного комплексу. Крім того, має значення і стан іонізації субстратів і кофакторів.

Отримання ферментних препаратів.

Для отримання ферментних препаратів використовують як мікроскопічні гриби, так і бактерії і дріжджі. Іноді отримання технічного ферментного препарату закінчується проведенням процесу ферментації, наприклад, в спиртовій промисловості для оцукрювання крохмалю використовують рідку культуру Aspergillus niger. Згодом її додають в рідкому вигляді в кількості 10-12% до осахареваемому затору.

Однак активність ферментів в культуральной рідини швидко знижується.

Тому широко практикують отримання сухих технічних ферментних препаратів.

Технічні препарати ферментів. Комплексний амілолітичні ферментний препарат отримують шляхом вирощування цвілевих грибів на твердому живильному середовищі з подальшою сушкою і подрібненням отриманої маси. Більш активний препарат ферменту отримують шляхом екстракції такого

"грибного солоду" з подальшим випаровуванням і сушінням. Ще більш активні ферментні препарати можна виділити з культуральної рідини шляхом осадження амілази ацетоном і подальшим висушуванням коагулятом при температурі 27-270С. Для осадження ферменту часто використовують і сульфат амонію. Попередньо культуральну рідина випарюють при температурі 400 С до 40%-ного вмісту сухих речовин. Коагулят сушать разом з наповнювачем.

Комплекс ферментів протеолітичної і амілолітичні дії отримують за допомогою культури Bacillus subtilis. Це аеробні, грампозитивні, рухливі палички. Для цих бактерій характерний дуже багатий комплекс гідролітичних ферментів. Як джерела живлення вони можуть використовувати білки, вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Bacillus subtilis культивують як методом поверхневого культивування на висівках, так і в рідких середовищах особливого складу за методом глибинного культивування.

Целлюлолітіческіе ферментні препарати. Виробництво целюлазу грунтується на використанні культури гриба Trichoderma viride.

Існуючі в даний час способи отримання целюлазу в глибинній культурі передбачає вирощування мікроорганізмів-продуцентів целюлазу на живильному середовищі, що містить як джерела вуглецю, як правило, очищену целюлозу, або ж містять її природні субстрати.

Але отримання целюлази з використанням як основного компонента природного середовища целюлози (наприклад, деревні опилки) пов'язане з рядом технологічних труднощів. Більш раціонально використання живильного середовища, що містить розчинний "індуктор". Такий живильним середовищем може бути молочна сироватка, основним компонентом якої є лактоза

(заздалегідь від молочної сироватки відокремлюють білок). В якості продуцента може бути використаний гриб Trichoderma lignorum, що дозволяє отримати весь комплекс целлюлолітіческіх ферментів, необхідний для розщеплення природних целлюлозусодержащіх субстратів.

Загальні методи визначення активності ферментів.

Перш ніж приступити до виділення ферменту , необхідно обрати і ретельно відпрацювати метод визначення активності, під контролем якого проводиться вибір найбільш ефективних прийомів очищення ферментів, а потім і виконання послідовних стадій його препаративної отримання. Активність ферменту змінюється при різних умовах реакції і залежить від температури, рН середовища, від концентрацій субстратів і кофакторів. З огляду на це, при визначенні активності ферменту на різних стадіях очищення необхідно суворо дотримуватися одні й ті ж умови. Бажано не обмежуватися визначенням активності по одному будь-яким методом. Кількість субстрату, перетворюване в умовах тесту з визначенням активності ферменту, що повинно бути пропорційно кількості останнього і часу інкубації. Якщо ж немає такої пропорційності, то активність розраховують за попередньо побудованому калібрувальний графік, що відбиває залежність швидкості реакції від кількості одиниць ферменту. Коли хід реакції нелінеен в часі, слід визначати початкову швидкість реакції (по тангенс кута нахилу дотичної до початкового відрізку кривої перетворення). Для цього найлегше застосовувати такі методи зміни активності, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічних і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-400С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактор, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей. У багатьох випадках додавання желатину, альбуміну та інших добавок запобігає денатурацію ферментного білка.

спектрофотометричних методи. Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дозволяє стежити за перебігом реакції у часі. Для цього реакційну суміш поміщають в кювету, вставлену в термостатіруемий кюветодержатель. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, характерної для використовуваного субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричних методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичної груп). Необхідно мати довільно вибрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичної щільності за певний час за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і т.д . Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка).

Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання поглинання світла, але також вимірювання флуоресценції - спектрофлюорометріческіе методи . Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флуоресценції. НАД та НАДФ у відновленому стані мають сильну флуоресценції і не флюоресцирующим в окисленні стані.

Тому спектрофлюорометрію використовують для вивчення кінетики і механізму дії нікотінамідних і флавінових ферментів.

Колориметричні (фотометричні) методи. В основі цих методів лежить вимірювання за допомогою візуального або фотоелектричного колориметр пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи ве?? ьма різноманітні.

Розроблені кількісні методи, засновані на біуретовой реакції, при якій складу білка, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язку, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретовие мікрометодом, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретовой реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Толин і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенних природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.

В даний час для визначення кількості білка широко користуються вимірюваннями інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот.

Кількість цих амінокислот у різних білках різному й, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчину, який містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність дорівнює

1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка.

Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі.

манометричні методи. Ці методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в газоподібному стані. До таких реакцій відноситься головним чином ті, що пов'язані з процесами окислення і декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом.

Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах

- манометричних апаратах Варбурга.

Інші методи. Сюди відноситься великий ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенції-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу на папері. Ці методи високочутливі і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі хроматографії (та електрофорезу).

Спеціальні методи визначення активності пепсину і папаїну. Пепсин і папаїн відносяться до однієї з найбільш численних груп ферментів - протеолітичні ферменти (протеази). Вони належать до класу гідролаз, до підкласу пептідгідролаз і каталізують розщеплення білків і поліпептидів у відповідності з рівнянням:

R1CONHR2 + H2O ® R1COOH + H2NR2,

R1 і R2 - залишки амінокислот, ді - або поліпептиди.

Тобто протеази каталізують розщеплення пептидного зв'язку ѕCOѕNHѕ.

Тепер трохи докладніше про пептідгідролазах.

Підклас пептідгідролаз поділяється на такі групи:

1. амінопептідази (a-аміноацілпептідгідролази) каталізують гідроліз поліпептидів за місцем пептидного зв'язку, що знаходиться поруч з вільною аміно групою. дію

R1 ферменту R2

| Ї |

H2N ѕ C ѕ C ѕ NH ѕ C ѕ C ѕ

| є | є

HOHO

2. карбоксипептидази (пептіділамінокіслотние гідролази) каталізують розщеплення поліпептидів за місцем пептидного зв'язку, що знаходиться поруч з вільною гідроксильної групою.

R

Ї | ѕCOѕNHѕCѕH

| дію COOH ферменту

3. діпептідази (діпептідгідролази) каталізують гідролітичні розщеплення на вільні амінокислоти.

NH2CH2CONHѕCH2ѕCOOH + H2O ® 2CH2NH2COOH глиця-гліцин гліколол

Діпептідази розщеплюють тільки такі пептидні зв'язку, по сусідству з якими знаходяться одночасно вільні Карбоксильна і аміну групи. Великий вплив на дію діпептідаз має наявність a-водневих атомів, що знаходяться у атомів вуглецю, пов'язаних з вільною карбоксильної і аміно групами. При заміні цих атомів іншими угрупованнями активність ферментів знижується або зовсім зникає.

4. протеїнази - (пептіділгідролази) гідролізують безпосередньо білок.

При цьому утворюються поліпептиди і вільні амінокислоти. До цієї підгрупи протеїназ належить пепсин, трипсин, хімотрипсин, папаїн та ін У процесі дії ферментів на субстрати вирішальну роль відіграє структура молекул субстрату (відповідна частина молекули субстрату), в якій відбувається розрив. Характер розпаду білкової молекули на пептиди й амінокислоти залежить від природи субстрату та зовнішніх умов

(рН, температури та ін.) Як білкових субстратів використовують желатин, гемоглобін, казеїн, сироватковий альбумін.

Методи визначення активності протеолітичних ферментів

модифікаційний метод. Модифікаційний метод із застосуванням субстрату казеїну заснований на визначенні швидкості ферментативної реакції гідролізу субстрату під дією досліджуваних протеолітичних ферментів, що містяться у матеріалі, взятому на аналіз. Швидкість реакції визначають за кількістю утворилися амінокислот - тирозину ((-аміно-

(-оксіфенілпропіоновая кислота) і триптофану ((-аміно-(- індолілпропіоновая кислота), які встановлюють колориметричне реакцією з реактивом Толин. Цим методом визначають вказані амінокислоти як у вільному, так і в зв'язаному стані.

За кількістю тирозину та триптофану, що міститься в гідролізаті, визначають кількість перетвореного білка в процесі ферментативної реакції (з розрахунку вмісту в білку 6% тирозину і 1.8% триптофану ). В основу розрахунку активності протеолітичних ферментів покладена залежність ступеня гідролізу білка від числа одиниць активності ферменту, введених в ферментативну реакцію. На основі цієї залежності складається графік.

Оскільки в даному методі кількість амінокислот, що характеризують кількість перетворюване білка, визначається за інтенсивністю забарвлення реакційних середовищ - оптичної щільності після реакції з реактивом, то в графіку для простоти розрахунку замість кількості перетвореного білка ставиться пропорційна йому оптична щільність розчину. При складанні графіка по осі абсцис відкладають число одиниць ферменту, введене в ферментативну реакцію, а по осі ординат - оптичну щільність, отриману після колориметричне реакції з реактивом

Толин.

Вміст білка, мг Одиниці активності

Залежність оптичної щільності від кількості перетвореного в процесі ферментативної реакції білка.

Залежність оптичної щільності від числа одиниць активності протеолітичних ферментів.

Відносячи кількість введених в реакцію одиниць активності ферменту до дії 1 г препарату, визначають його активність . Для розрахунку прямої, зображеної на графіку, становить розрахункове рівняння.

За одиницю протеолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, що каталізує за 30 хвилин гідроліз 1 г білка в прийнятих умовах до продуктів, не обложників трихлороцтової кислотою. 1г становить 25% від взятого на ферментативну реакцію білка.

протеолітична активність характеризується числом одиниць активності ферменту, що міститься в 1 г препарату і твердих напівпродуктів або в 100 мл рідких матеріалів. Метод призначений для аналізу очищених ферментних препаратів грибного походження і усіх напівпродуктів, що виходять при їх виробництві.

Визначення пепсину по Ансону і Мирському. Даний метод заснований на наступних принципах. Гемоглобін піддають дії пепсину, що залишився гемоглобін беруть в облогу трихлороцтової кислотою. Фенольні властивості залишку (тирозин), що визначаються фотометричним, використовують як міру активності ферменту.

Субстратом служить 2%-ий розчин гемоглобіну в 0.06 н. розчині соляної кислоти, 5 мл субстрату нагрівають до 250С, додають 1 мл розчину ферменту, залишають на протязі 10 хв., додають 10 мл 0.3 н. розчину трихлороцтової кислоти, енергійно збовтують, фільтрують і 5 мл фільтрату відливають в мірну колбу на 25 мл. Сюди ж доливають 10 мл

0.5 н. розчину їдкого натру і 3 мл фенольного реактиву (реактив Толин-

Чіокалтеу розводять попередньо подвійним об'ємом води) і доводять водою до позначки. Після закінчення декількох хвилин пофарбований розчин фотометріруют щодо стандартного розчину, що містить 0.0008 мекв тирозину в

5 мл 0.2 н. розчину соляної кислоти (до розчину додають 0.5% формальдегіду як антисептик). Для виключення можливих помилок ставлять холостий досвід. Одиниці пепсину виражають у мілліеквівалентах тирозину (в межах від 6.10-4 до 11.10-4): одиниці пепсину = мілліеквіваленти тирозину х1.47 .

Визначення протеолітичних ферментів за Муру та Штейн. Метод заснований на тому, що містять (-аміногрупу амінокислоти дають з нінгідрідом забарвлену похідну - дікетогідрінділідендікетогідріндамін, а також альдегід-амінокислоти і вуглекислоту.

Пофарбований продукт має характерний максимумом поглинання при

570 м (, а інтенсивність забарвлення залежить від кількості амінокислоти. З проліну і оксіпіроліном реакція протікає в іншому напрямку, а максимум поглинання одержуваного при цьому пофарбованого продукту розташований за 440 м (.

Інкубація ферменту зручно проводити в мірних колбочка по 5 мл, в яких змішують і врівноважують при постійній температурі на водяній бані всі компоненти за винятком ферменту. Після цього додають фермент, розчин змішують і беруть проби для дослідження. Для кінетичних вимірювань концентрацію ферменту бажано підібрати таким чином, щоб аліквотние частини можна було б брати кожні 5 хвилин.

Аліквотние частини проби, взяті відразу ж після додавання ферменту, а потім через відповідні інтервали, додають у фотометричні пробірки, що містять 2 мл реактиву нінгідріда - це негайно обриває реакцію. Після цього суміш 20 хв. нагрівають на водяній бані; отримана забарвлення стійка мінімум 24 години. Середня помилка при аналізі повторних проб становить (2%. Після розведення кип'яченої суміші проби і нінгідріда 10 мл суміші, що складається з рівних обсягів води і н.пропанола, інтенсивність забарвлення визначають на спектрофотометрі Колеман при 570 м (.

Для калібрування користуються постійними кількостями стандартних амінокислот, що містять реакційні частини. За допомогою калібрувальних кривих, побудованих окремо для кожної досліджуваної амінокислоти , вимірювання інтенсивності забарвлення (по відношенню до контрольної колбі) перераховують у міллімолі. При розподілі цих величин на міллімолі субстрату, використаного в процесі реакції, можна знайти відсоток гідролізу.

Побудова калібрувальною кривий виключає помилки, що відбуваються від якісних відмінностей реакції амінокислот на кольоровий реактив. До оптичної щільності 0.1 залежність між величиною поглинання і кількістю субстрату носить лінійний характер.

Відтворюваність становить (3%. заважає вплив амонію, амінів та інших речовин, що містяться в біологічному матеріалі і дають кольорову реакцію з нінгідрідом, виключається за допомогою відповідних холостих проб. Аналіз порівняно спрощується, коли вивчають протеолітичні ферменти, субстратами яких є пептиди, що не містять вільних аминогрупп. У цьому випадку вся інформація, що утворюється забарвлення цілком припадає на звільнилася амінокислоту.

мікрометодом визначення активності протеїназ А. П. Алексєєнко.

Пропонований мікрометодом визначення активності протеолітичних ферментів заснований на вимірюванні вмісту аргініну в пептидах, що звільняються при гідролізі протеїназ білкових субстратів.

Зміст аргініну визначають за допомогою стабілізованої і вдосконаленою реакції Сакагучі (хроматограм занурюють в 0.1% розчин 8-гідроксихінолін в ацетоні, висушують на повітрі, обприскують розчином 0.2 мл Br2 в 100 мл 0.5 М NaOH; аргінін та інші гуанідинів дають помаранчево-червоні плями, тауроміцін і глікоціамін - лише тимчасову забарвлення ), що дозволяє визначити вміст аргініну в розчинах трихлороцтової кислоти після осадження та видалення нерозчинних білків.

Знаючи вміст аргініну в білковому субстраті і визначаючи його кількість в перейшли в розчин пептидах, можна розрахувати відсоток гідролізу білкового субстрату досліджуваними протеїназ. У цьому полягає головна перевага методу, оскільки метод Ансон не дає можливості розрахувати відсоток гідролізу білка, атакується протеолітичними ферментами. З усіх існуючих методів тільки метод Мура і Штейна дозволяє визначити відсоток гідролізу білкових субстратів, але він має обмежене застосування, оскільки вимагає попереднього проведення повного кислотного гідролізу як білка-субстрату, так і утворилися пептидів. У запропонованій методиці калібрувальна крива будується за розчинів вільного аргініну. Введення в реакцію пептидів і білків у вигляді їх біуретових комплексів підвищило чутливість реакції Сакагучі із залишками аргініну і зробило її такою ж чутливою, як і для вільного аргініну. Як білкового субстрату використовують класичний субстрат - гемоглобін і окислений по Сангеру лізоцим. Цей низькомолекулярний білок, що містить 12.7% аргініну чудово розщеплюється пепсином (рветься близько 30 зв'язків).

Перш ніж приступити до визначення активності ферментів у вивчаються тканинних субстратах, необхідно:

1. Визначити залежність активності від рН і вибрати оптимальну реакцію середовища для прояву активності досліджуваного ферменту.

2. Побудувати графік залежності активності ферменту від часу його інкубації з субстратом. вибрати для роботи ті терміни інкубації, при яких зберігається лінійна залежність між величиною активності ферменту і часом його інкубації.

3. Визначити залежність величини активності від концентрації білка в пробі. Вибрати такі концентрації ферменту, при яких величина активності ферменту була б пропорційна його концентрації. Слід враховувати, що в тканинних екстрактах і біологічних рідинах можуть бути присутніми інгібітори протеолітичних ферментів. При розведенні проби їх концентрація знижується, а протеолітичних - збільшується.

Визначаючи "фактор розведення", можна одночасно з підбором оптимальних умов для визначення протеолітичної активності виявити та наявність інгібітору.

4. При визначенні активності ферменту необхідно працювати при постійній швидкості ферментативної реакції, що досягається при повному насиченні ферменту субстратом, при так званій максимальної швидкості ферментативної реакції. У кожному окремому випадку максимальну швидкість необхідно знайти експериментально, вимірявши активність препарату при різних концентраціях субстрату, при постійних концентраціях білка і часу інкубації.

Визначення активності протеїназ по білкового субстрату.

До 0.5 мл субстрату у відповідному буферному розчині додають 0.5 мл проби, що містить фермент (екстракт, біологічну рідина), інкубують встановлене дослідним шляхом час, після чого білки в пробі беруть в облогу 5 мл 10% трихлороцтової кислотою. Відокремлюють осад центрифугуванням, а надосадову рідина (Тху-центріфугат) піддають подальшій обробці.

Контрольні проби - проби, де реактив доданий у зворотному порядку: до 3 мл 10% розчину Тху додають 0.5 мл розчину, який містить фермент і 0.5 мл субстрату. Рекомендується ставити пробу на Автоліз субстанціїрату: до 0.5 мл субстрату додають 0.5 мл прокип'яченого розчину, який містить фермент, інкубують разом з досвідченими пробами і обложеної Тху.

Визначення вмісту аргініну в Тху-центріфугантах за модифікованою реакції Сакагучі. До 0.5 мл Тху-центріфуганта додають

0.5 мл 2.5мм розчину CuSO4, 0.5 мл 5 Н. КОН, 0.5 мл розчину ДХН (2,4 - дихлор-1-нафтол). Розчин струшують і вносять 0.5 мл гіпоброміта натрію, миттєво виникає яскраво-рожеве забарвлення. Розчин струшують і через 20-30 секунд стабілізують проби додаванням 0,2 мл розчину 2 - тіогліколя (щоб запобігти руйнуванню пофарбованого продукту надлишком гіпоброміта натрію. Додавши 2-тіодігліколя в проби як досвідчені, так і контрольні, з'являється жовтувате фарбування за рахунок побічного продукту реакції між надлишкової Тху і гіпоброміта натрію.

Побічний продукт також стабілізується 2-тіодігліколем. Оптична щільність проби вимірюється спектрофотометром при 520 нм в кюветі товщиною 1 см.

Визначення активності протеїназ по реакції з реактивом Толин . К

0.5 мл того ж Тху-центріфуганта додають 0.5 мл 2.5 мм розчину CuSO4

, 4 мл 0.5 н. розчину NaOH і 1.5 мл розведеного у три рази реактиву

Толин. Через 30 хвилин вимірюють на спектрофотометрі оптичну щільність при 760 нм

Калібрувальні криві по пепсіновому гідролізату окисленого лізоциму. 30 мг окисленого лізоциму розчиняють в 50 мл підкисленою води (40 мл Н2О + 10 мл 0.3 н . розчину HСl. і до отриманому розчину додають 0.5 мг пепсину. Суміш залишають при кімнатній температурі на добу. Після закінчення цього терміну інкубації препарат не дає осаду з Тху.

Цей препарат використовують поряд з розчинами аргініну і тирозину в як стандарт для побудови калібрувальних кривих. Поставлений розведення з вмістом від 60 до 600 мкг/мл вихідного лізоциму. У проби вводять відповідне досвідченим пробам кількість Тху. Поставлений також розчини вільного аргініну і тирозину з концентраціями від 0.04 до 0.25 мкмоль/мл. З кожної проби беруть по 0.5 мл (у трьох паралельних пробах) для визначення вмісту аргініну і тирозину по Толин.

Калібрувальні криві. 3 отримана за допомогою мікрометодом на основі реакції Сакагучі (520 нм) з розчинів аргініну (х) і по пептидного гідролізу лізоциму (о); 1 і 2 - за допомогою реакції Толин (760 нм): 2 - по розчинів тирозину, 1 - за пептидного гідролізу лізоциму. Значення оптичної щільності проб, виміряні при 520 нм чи 760 нм, нанесені на графік проти концентрації аргініну або тирозину або їх залишків у пепсіновом гідролізаті лізоциму. Крива 1, що проходить вище кривої 2, отримана при реакції реактиву Толин з роз-

Кількість амінокислоти або її залишку в гідролізаті в наномолях на 1 мл. творами тирозину еквівалентної концентрації. Крива 3 отримана в результаті реакції Сакагучі як з вільним аргініном, так і з його залишками, що містяться в пептидах пепсінового гідролізату лізоциму.

Розташування досвідчених точок точно по прямій свідчить про те, що в гідролізаті, обложеному Тху, весь аргінін повністю реагує з реактивом З