Міністерство освіти Російської Федерації
Самарський Державний Університет
Реферат на тему:
одержання моноклональних антитіл
Виконала студентка 542 Б групи біологічного факультету СамГУ
Миронова Ірина
Самара
2001
Введення
Для багатьох досліджень, пов'язаних з вивченням біологічних структурвелику цінність представляють реагенти, здатних специфічновзаємодіяти з даною структурою. Універсальним реагентом, що володієзазначеним властивістю, вважається молекула імуноглобуліну. Незважаючи на те,що імуноглобуліни, будучи антитілами, взаємодіють тільки зантигеном, тобто з молекулою здатної викликати імунну відповідь, длябільшості структур вдається підібрати умови, за яких вони стаютьантигенами і індукують вироблення комплементарних антитіл (наприклад, прикон'югації з сильними імуногенний). Саме цим пояснюється великапоширення імунологічних методів, пов'язаних з використаннямантитіл, у різних галузях біології та медицини.
Серйозну проблему при застосуванні антисироваток для ідентифікації такількісного визначення антигенів у різних галузях дослідженьпредставляє неспецифічне зв'язування та перехресна реактивністьантитіл.
Історія створення методу
Багато дослідників намагалися відшукати способи отримання антитіл звузькою специфічністю. Так, за певних умов імунізаціїбактеріальними полісахаридами вдається отримати високогомогенний апаратантитіл з вузькою специфічністю. Крім того, можливе злиття плазмацітоми
(пухлини, що виникла з антітелообразующей клітини або її попередника) зклітинами селезінки імунізованих тварини, отримавши таким чиномгібридні клітини (гібридоми), що успадкували від пухлинних клітинздатність необмежено розмножуватися, а від клітин селезінки --синтезувати антитіла зумовленої специфічності.
Передумовами для виникнення методу отримання гібридом,синтезують моноклональні антитіла, були розробки двохметодологічних підходів:
1) одержання мієліт, адаптація їх до умов культивування поза організмом;
2) метод соматичної гібридизації клітин.
У мишей досить легко отримати мієломи (плазмацітоми). Ці пухлиниє нащадками однієї клітини (тобто мають моноклональніпоходження) і секретують унікальні імуноглобуліни, деякі зяких можуть взаємодіяти з відомими антигенами. Пухлини індукуютьу тварин шляхом внутрішньочеревно введення мінеральних масел або інертноготвердого пластика. Для виникнення мієліт велике значення маєгенетичний статус тварини, і лише у двох ліній мишей інбреднихекспериментаторам вдалося отримати такі пухлини.
Мієломні клітини миші виявилися надзвичайно зручними для вивчення біохіміїпродукції імуноглобулінів і дали дуже багато чого для розуміння структури,механізмів секреції та їх функції. Однак, мієломна система як джерелоантитіл до антигенів більшості не виправдала надії дослідників - невдавалося імунізувати тварин, а потім отримати мишачі мієломи,продукують антитіла до іммунізірующіе антигену. З тисяч мієломнихпухлин, індукованих у мишей, лише поодинокі вироблялиімуноглобуліни, які реагували з відомими антигенами, що буловиявлено шляхом грубого скрінірованія з безліччю потенційнихантигенів. Таким чином, мієломні білки виявлялися з невідомоюантигенної специфічністю.
Іншою передумовою виникнення методу отримання гібридом з'явилася технікагібридизації соматичних клітин, розробка яких широко проводиласяпісля відкриття феномену спонтанної гібридизації. При злиття плазматичнихмембран клітин утворюються клітини з двома або більшою кількістю ядер --гетерокаріони. Після першого поділу ядра зливаються і утворюється одне ядроз набором хромосом від всіх злилися партнерів - утворюється гібриднаклітина. Низьку частоту утворення гібридів можна було збільшити,використавши ряд агентів, що викликають злиття: вірус Сендай, лізолецітін,поліетиленгліколь.
Навіть при використанні агентів, що підвищують злиття, частота утворюютьсягібридів є вкрай низькою. Для їх виділення необхідні селективні середовища,дозволяють зростати переважно утворився гібридів. В данийчас розроблено кілька принципів селекції гібридних клітин. Одним знайбільш поширених є метод, заснований на застосуванні системи,містить гіпоксантин, амідоптерін і тимідину (система ДАТ).
Селекція гібридних клітин заснована на тому, що в ДАТ середовищі батьківськімієломні клітини гинуть, а нормальні клітини селезінки не володіютьздатністю рости за даних умов культивування, так що виживають ірозмножуються лише гібридні клітини, що успадкували від батьківських клітинздатність розмножуватися і синтезувати специфічні імуноглобуліни.
Підготовчі етапи перед проведенням злиття
Повністю процедура отримання моноклональних антитіл включає в себенаступні етапи:імунізація тварин;підготовка клітин до злиття;злиття;відбір індукують специфічні антитіла клонів;клонування і реклонірованіе;масова напрацювання гібридомної клітин;отримання культуральної рідини або асциту, що містять антитіла;виділення антитіл.
Зазвичай вся процедура від моменту початку імунізації до виділення антитілзаймає 3-4 місяці.
Організація роботи та обладнання. Для роботи з одержання гібридомбажано виділити окреме приміщення. Експеримент можна проводити і вчастини великої кімнати, максимально віддаленої від вхідних дверей. Цеприміщення треба оснастити таким устаткуванням:
Ламінарний бокс з вертикальною або горизонтальною подачею стерильногоповітря. Стерильність забезпечується наявністю фільтрів, що затримуютьчастки більше 0,3 мкм.
Інкубатор, у якому автоматично підтримується вологість, температура іконцентрація СО2.
Повільна центрифуга з підвісними склянками, бажано зохолодженням.
Загальний та інвертований мікроскопи з фазово-констрастним пристроєм.
Холодильник на 4 і на -200 С.
Водяна баня на 37 і 560 С.
Крім цього в окремому приміщенні бажано мати морозильник на -700 С іпосудину Дьюара з рідким азотом для зберігання клітин. Для отримання гібридомпотрібно придбати також спеціальну пластиковий посуд для культури клітин:
96-ямковий планшети з плоским дном, 24-ямковий планшети, флакони зплощею зростання 25, 75 см2 та ін, пластиковий посуд для проведенняімуноферментного і радіоімунологічна аналізів, середовища длякультивування, необхідні реактиви, сироватку плоду корови (СПК).
Приготування окремих компонентів середовищ для культивування. Основнимисередовищами, що вживаються для отримання гібридом, є середа RPMI 1640 іСереда Голка в модифікації Дульбекко. Застосовуються й інші середовища, вЗокрема, середа Дульбекко в модифікації іксів. Середовища випускаються у виглядіготових розчинів, 10-кратних концентратів і сухих порошків. Кращірезультати виходять при приготуванні середовищ в умовах лабораторії зсухих порошків, однак при цьому важливе значення має якість води. Дляприготування середовищ необхідна деіонізірованная і двічі перегнала вкварцовою посуді вода.
Вибір експериментального тварини. Зазвичай для імунізації використовують мишейі щурів. Це пов'язано з тим, що відповідні мієломні клітини мишей та щурівшироко поширені і, крім цього, не представляє складнощіввирощування отриманих гібридом в організмі цих тварин.
Інші тварини практично не використовуються.
При імунізації тварин імунну відповідь виробляється на всі антигеннідетермінанти всіх компонентів що вводиться матеріалу. Це значноускладнює відбір клонів, що продукують антитіла до цікавої антигенноїдетермінанті, так як їх частка може бути вкрай незначною. Тому заможливості для імунізації застосовують очищені антигени, принаймніна останніх етапах імунізації. Одним з основних достоїнств гібридомноїтехніки і є якраз та обставина, що специфічні антитілапроти даного антигену можна отримати, взявши для імунізації неочищенийпрепарат антигену, і вживши згодом ці антитіла для очищенняантигену.
Способи імунізації. Призначення процесу імунізації полягає в тому, щобзбільшити частку клітин, які продукують антитіла заданої специфічності, іперевести ці клітини в функціональний стан, при якому вони здатнізливатися і утворювати антітелообразующіе гібридні клітини.
Експериментально встановлено, що для гібридизації необхідні виділятиселезінковий клітини тварин через 3-4 доби після останнього введенняантигену, тобто тоді, коли в лімфоїдних органах багато активнопроліферуючих клітин.
Конкретна схема імунізації сильно залежить від природи антигену і йогоімуногенності. Антигени клітинної поверхні є сильнимиімуногенний, тоді як більшість розчинних білків - слабкі іммуногени.
В останньому випадку необхідно застосовувати різні ад'ювант, що підсилюютьімунну відповідь. Серед ад'ювант найбільше поширення отримав повнийад'ювант Фрейнда (ПАФ). Крім цього, використовують введення антигену,преціпітірованного на галун, і введення разом з антигеном убитих клітин
Bordetella Pertussis. Зазвичай антиген вводять неодноразово, що необхіднодля розбудови сильної імунної відповіді, хоча надмірна імунізація можемати зворотний ефект - зазначено, що іноді у клітин гіперіммунізірованнихтварин знижується здатність утворювати гібридоми. У деяких випадкахбуває досить і імунізації.
По ходу імунізації необхідно визначати титр антитіл до антигену (титрантитіл - величина, обернена розведення сироватки, при якій ступіньімунологічної реакції знижується в два рази в порівнянні з максимальною).
Зазвичай це роблять перед останньою імунізацією. У досвід набирають тварин звисоким титром антитіл. Не слід очікувати хороших результатівгібридизації, якщо при імунізації тварин немає утворення антитіл або вониутворюються в низькому титрі.
Для більшості розчинних антигенів можна використовувати наступну схемуімунізації.
Вводять 1-100 мкг антигену в ПАФ або у вигляді преципітату на галунвнутрішньочеревно. Якщо є можливість, то одночасно вводять 2 * 109 убитихклітин B. Pertussis.
Через 2-3 тижні вводять антиген на фізіологічному розчині внутрішньочеревноабо внутрішньовенно. Цю процедуру можна повторювати до появи високого титруантитіл.
Останню імунізацію роблять внутрішньовенно, через 3 доби жовтнязабиваються, і готується суспензія клітин для гібридизації.
При застосуванні як іммуногена різних клітин (пухлинні клітини,чужорідні клітини крові, бактерії, паразити тощо) роблять кількаін'єкцій без ад'ювант внутрішньочеревно з інтервалом в 2-3 тижні по (1 -
5) * 107 клітин. Останню ін'єкцію роблять внутрішньовенно і через 3 дня виділяютьклітини селезінки для гібридизації.
Останнім часом активно розвиваються методи повної імунізації позаорганізму з метою отримання гібридоми. Імунізація in vitro має рядістотних переваг:коротшає період імунізації до 4-5 діб;потрібно істотно менша кількість антигену;до багатьох антигенів можна отримати більш виражений імунну відповідь
(частково за рахунок зниження внеску толерантності та супресії);підвищується відсоток відповідають клітин;легко перевіряти фактори, що впливають на ефективність імунізації.
Сучасні методи імунізації in vitro засновані на двох системахкультивування лімфоцитів, розроблених в кінці 1960-х років. Методсуспензійного культивування був першим методом, в якому імунізаціяповністю проходила поза організмом. Критичними факторами в цьому методібули низька концентрація кисню в атмосфері (7%), висока щільністьклітин, легке гойдання культури, щоденне додавання свіжої середовища івибір відповідної партії СПК та антигену (використовували еритроцити барана).
Інший основною системою імунізації in vitro є метод Д. Марбрука.
Клітини культивують в маленькій камері на діалізної мембрані, через якуйде обмін середовищем з великого резервуара.
Одним з основних недоліків імунізації in vitro є частка IgM -утворюють клонів. Це пов'язано з тим, що при імунізації in vivo клітиниберуть під час вторинної імунної відповіді, при якому утворюються восновному антитіла класу IgG, тоді як in vitro реакція йде по первинномутипу, для якого характерна продукція IgM антитіл. Ця проблема можебути подолана після відпрацювання способів отримання вторинної імунноївідповіді in vitro.
Злиття
Існують два основні варіанти додавання ПЕГ, що використовуються в данийчас. Перший методу полягає в наступному. Протягом 1 хв додають 1мл 50% розчину ПЕГ при 370 С з постійним перемішуванням. Потім розчинпоступово розбавляють до 10 мл протягом декількох хвилин середовищем безсироватки, після чого клітини центріфугіруют і ресуспендіруют в середовищікультивування.
У другому методі використовують більш тривалу обробку клітин розчином
ПЕГ. До осідання клітин додається 30-35% ПЕГ при кімнатній температурі.
Клітини центріфугіруют 2 хв, потім їх залишають при кімнатній температуріще на 5-7 хв. Потім їх розводять у великому об'ємі середовища з сироваткою,обмивають і культивують.
Клонування гібридомної клітин
Клонування здійснюється для виділення стабільних клонів гібридомноїклітин. Для нещодавно утворених гібридомної клітин характерна високанестабільність, пов'язана з втратою хромосом. При культивуванні можутьз'являтися клітини, що втратили здатність продукувати антитіла і вониможуть переростати антітелообразующіе гібридні клітини.
До основних методів клонування клітин відносяться клонування методомлімітують розведень, клонування в напіврідкому агарі і клонування здопомогою приладу - проточного цитофлуориметр.
Клонування методом лімітують розведень. Якщо клітини посіяні в 96 --ямковий планшети дуже рідко, то частка лунок, в якій спостерігається зростанняклітин, підкоряється розподілу Пуассона:
де f (0) - фракція лунок, в яких відсутній ріст; (- середнє числоклітин на лунку.
При (= 1 f (0) = 0,37. Для того, щоб отримати розумну імовірністьтільки одного клону в лунці, у більш 37% лунок не повинно спостерігатися зростанняклітин. Оскільки ефективність клонування рідко буває що дорівнює 100%,клітини необхідно засівати при щільності 10, 3 і 0,5 клітин на лунку. У тихпланшетах, на яких спостерігається зростання в половині лунок, містятьсяізольовані клони.
При першому клонування активної може виявитися лише невелика частинаклонів. Необхідно завжди вчинити повторне клонування, при якомучастка позитивних клонів буде зростати.
Для клонування треба застосовувати клітини живильного шару. Використовуються ті жвиди клітин, що і для початкового росту гібридом.
Клонування в напіврідкому агар-агарі. Для клонування гібридом можназастосовувати напіврідкий агар. Зазвичай береться система, що складається з двох шарів.
Нижній (твердий) шар містить 0,5% агар-агару в середовищі культивування. Йомудають затвердіти. Потім додають другий шар - м'який, що містить 0,3% агар -агару, до якого включаються клонують клітини. При використанні клітинживильного шару їх засівають в чашку Петрі до заливки агар-агару, і середукультивування видаляють безпосередньо перед додаванням нижнього шаруагару.
Колонії стають видимими через 7-14 діб, їх переносять на рідкукультуру.
Клонування за допомогою проточного цитофлуориметр. Готуютьфлуоресцентні мікрошарікі з латексу і покривають їх антигеном. Такікульки адсорбуються на антігенспеціфіческіх гібридомної клітинах, щодозволяє виділяти їх на цьому приладі.
Після виділення той чи інший спосіб позитивних клонів, що клітини цихклонів розмножують в достатній кількості і зразки їх заморожуються.
Масова напрацювання моноклональних антитіл
Після відбору гібридомної клітин, які синтезують цікавлять дослідникаантитіла, можна приступити до їх масового нарощування з метою отриманнявеликої кількості моноклональних антитіл. На початку культивуваннягібридомної клітини можуть рости повільно й погано переносити низьку щільністьпосіву. У зв'язку з цим при пересіванні клітин їх треба розводити не більш ніж у
3-5 разів. Прискоренню росту клітин може сприяти додавання клітинживильного шару. Гібридомної клітини необхідно підтримуючить влогарифмічної фази росту і уникати підвищення концентрації клітин вище
0,5 млн/мл. Клітини можна культивувати як у стаціонарній культурі, так ів роллерниє, а також у різного роду культиваторах (ферментера).
Для отримання максимальної продукції моноклональних антитіл клітинамдозволяють рости до граничної щільності. У такій культурі черезпевний час спостерігається загибель гібридомної клітин. Надосадовурідина збирається, а клітинний осад відкидається, тобто не намагаютьсякультивувати далі залишилися живі клітини.
Для отримання великої кількості антитіл вводять гібридомної живі клітини ворганізм тварин і отримують від них асцітную рідина. Попередньотваринам вводять агенти, які підвищують здатність гібридом рости в черевнійпорожнини. В якості агента найчастіше виступає пристав - 0,5 мл за
10-14 діб до введення клітин.
Очищення антитіл
Для багатьох цілей не потрібно очищення антитіл, і вони використовуються у виглядікультуральних рідин або асцітних рідин. Грубу іммуноглобуліновуюфракцію можна отримати висолювання білків сульфатом амонію з наступнимдіалізом. Якщо антитіла необхідно виділити в чистому вигляді, топопередньо визначають їх клас і підклас, так як способи очищеннярозрізняються для антитіл різних класів. Це можна зробити за допомогою методуіммунодіффузіі по Ухтерлоні.
Виділення чистих антитіл найкраще проводити на іммуносорбентах. При цьомуметод, однак, є небезпека, що при фіксації змінюється антигеннаструктура клітинної поверхні.
Якщо не вдається виділити антитіла прямим способом, то отримуютьіммуноглобуліновую фракцію за допомогою різних методів афінної ііонообмінної хроматографії на сефарозес пришитим ковалентно білком А.
Висновок
Одне із завдань клітинної інженерії полягає в створенні клітинних систем зновими властивостями на основі клітинних взаємодій. В даний часудосконалюються методи імунізації поза організмом і вивчаються механізмиактивації В-лімфоцитів. Це особливо важливо для отримання моноклональнихантитіл людини.
Однією з умов подальших успіхів на шляху отримання клітин і клітиннихсистем з новими властивостями є поглиблення знань, що стосуютьсяфундаментальних основ біології: механізмів регулювання процесу клітинноїдиференціації, фізіології протопластів як об'єкта біологічноїтрансформації клітин, взаємин клітинних органел. Отже,прогрес у розвитку клітинної інженерії буде в значній мірівизначати успіхи в області клітинної біології та клітинної фізіології.
