ЗМІСТ
Введення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .3
1. Принципи конструювання рекомбінантних противірусних вакцин ... ... ... ... .. 4-24
1. Отримання відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти ... ... ... ... ... .... ... .4
2. Вибір високоактивної і добре вивченою в імунологічному відно-
шеніі моделі вектора-носія і клонування відповідного гена ... ... 9-21
1. Отримання рекомбінантних ДНК ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 9
2. Отримання рекомбінантних РНК ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 11
3. Стратегія клонування генів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... 13
4. Різноманітність векторних молекул ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 17
3. Вибір системи експресії клонованої гена, здатної забезпечити максимальний вихід і функціональну повноцінність продукту ... ... ... ... ... .. 22
4. Створення досить зручних і по можливості універсальних векторів для цільової доставки генів в клітини і тканини організму ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 23
2. Вакцина проти лейкемії кішок, виготовлена за допомогою генної інженерії ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... 24
Список літератури ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .26
ВСТУП
Існуючі традиційні вакцини, незважаючи на очевидний позитивнийефект їх широкого застосування, мають низку недоліків. До них відносяться:наявність небажаних біологічно активних і баластних компонентів упрепаратах, неповноцінні імунологічні властивості самих антигенів. Крімтого, існують захворювання, які не викликають імунітету, вакцини протияких взагалі відсутні і не можуть бути сконструйовані на основікласичних принципів. Все це викликає необхідність удосконаленнявже існуючих вакцин і створення принципово нових типів вакцин. Однимз найбільш перспективних напрямків у цій галузі є одержаннявакцинних препаратів на основі методів генної інженерії.
Останнім досягненням генної інженерії і біотехнології стало створеннярекомбінантних противірусних вакцин, що містять гібридні молекулинуклеїнових кислот. Дані вакцини мають цілу низку переваг. Вонихарактеризуються відсутністю (або значним зниженням) баластнихкомпонентів, повної нешкідливістю, низькою вартістю, яка пов'язана зздешевленням промислового виробництва вакцин. Експрессіруемий в клітинахвакцинованих тварин білок має конформацію, близьку до нативної, імає високу антигенної активністю.
Таким чином, рекомбінантні противірусні вакцини єновітнім поколінням вакцин. Їх очевидна перевага обумовлює широкезастосування даного типу вакцин в медицині та ветеринарії для вакцинаціїнаселення і сільськогосподарських тварин.
1. ПРИНЦИПИ КОНСТРУЮВАННЯ Рекомбінантні
ПРОТИВІРУСНОЇ ВАКЦИНИ
Важливою умовою отримання ефективного вакцинного препарату єдотримання основних принципів його виробництва. Конструюваннярекомбінантних противірусних вакцин передбачає: 1) одержаннявідповідного фрагмента нуклеїнової кислоти; 2) вибір високоактивної ідобре вивченої в імунологічному відносно моделі вектора-носія іклонування відповідного гена (або генів); 3) вибір системи експресіїклонованої гена, здатної забезпечити максимальний вихід іфункціональну повноцінність продукту; 4) створення досить зручних і поможливості універсальних векторів для цільової доставки генів в клітини ітканини організму.
1.1. ОТРИМАННЯ відповідний фрагмент
Нуклеїнові кислоти
Для конструювання рекомбінантних РНК або ДНК необхідно отриматифрагмент нуклеїнової кислоти, який в подальшому і буде вбудовуватися ввекторну молекулу.
Фрагменти ДНК для вбудовування в вектор можна отримати безпосередньоз хромосомної ДНК, розщепивши її рестріктазамі або зруйнувавши випадковимчином (наприклад, за допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковоюзавдовжки. Виділення генів за допомогою "вирізування" з генома, як правило,складається з чотирьох етапів: 1) одержання клонотекі фрагментів геному; 2)виявлення фрагментів геному, що містять необхідний ген, і точналокалізація гена в даному фрагменті; 3) вирізання гена з фрагмента (ів) здопомогою рестріктаз і зшивання ділянок гена за допомогою ДНК-лігази фага Т4,якщо ці ділянки отримані з різних фрагментів; 4) ампліфікація гена вскладі векторної молекули. Вказаний спосіб одержання генів єнайбільш прийнятним стосовно протозойні збудників, бактерій ідля деяких складно влаштованих ДНК-вірусів. Такі операціїпроводяться, зокрема, при створенні так званих "бібліотек генів", тоє набору однакових векторних систем, у сукупності що несуть в собі весьгеном цього організму. Однак цей підхід має ряд істотнихнедоліків. По-перше, дуже складна задача підбору рестріктаз, що дозволяютьвирізати з геномної ДНК або клонованої фрагмента геному цілісний ген.
Як правило, разом з геном залишаються фланкуючі його зайві нуклеотидніпослідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або жрестріктази відрізають частину гена, роблячи його функціонально неповноцінним. По -друге, створення клонотекі генома збудника представляє спеціальнузавдання і вимагає великих витрат часу. Нарешті, для ряду ДНК-вміснихвірусів (паповавіруси) доведений сплайсірованний характер структури генів.
Цілком зрозуміло, що виділені гени цих вірусів внаслідок наявностіінтрони областей не будуть проявляти функціональної активності вбактеріальних клітинах і виявляться непридатними при вирішенні задач поконструювання рекомбінантних противірусних вакцин. По-третє, якщо генскладає незначну частку від усієї геномної ДНК, то виникають великітруднощі з його ізоляцією і ідентифікацією.
Найбільш поширеним є шлях отримання генів через синтез
ДНК-копій (Комплементарна ДНК) інформаційних чи будь-яких інших (в оптимальному випадку
- Індивідуальних) РНК шляхом їх зворотної транскрипції. Даний спосібвключає в себе три етапи: 1) виділення високоочищених мРНК, що кодуютьіндивідуальні структурні білки, або виділення геномних РНК вірусів; 2)синтез дволанцюжкової ДНК (гена) на матрицях РНК; 3) ампліфікація гена здопомогою методів молекулярного клонування. Як
зазначалося, першим етапом в отриманні генів за допомогою методівзворотної транскрипції служить виділення і очищення геномних РНК та мРНК.
Геномні РНК виділяють головним чином з очищених віріонів, а мРНК - зінфікованих клітин. Для виділення мРНК з інфікованих клітинвикористовують різні способи. В одному з варіантів виділення мРНК зінфікованих клітин проводять безпосередньо з ціалізуватися клітин
(лізис здійснюють у денатуруючих середовищах з метою запобіганняруйнуючої дії Нуклеази на мРНК) з подальшою екстракцією фенолом іхлороформом або центріфігурірованіем лизати через подушку 5,7 M СsCl (длязвільнення від клітинних ДНК) і заключної афінної хроматографією наоліго (Dт)-целюлозі (полі (У)-сефарозе). Виділення мРНК можна проводити і зочищених полірібосом інфікованих клітин.
У разі необхідності отримання специфічних мРНК, що кодуютьіндивідуальні структурні білки збудника, використовують наступний спосіб.
Інфіковані вірусом клітини руйнують механічним шляхом або хімічнимиметодами (використання неіонних детергентів). Клітинний лізат звільняютьвід ядер і мітохондрій методом диференціального центрифугування іпіддають хроматографії на антитільний сорбенті. При цій процедурі зантитілами, специфічними до певного структурному білку збудника,зв'язуються полісоми, що здійснюють синтез цього білка. Також може бутивикористаний метод непрямої іммунопреціпітаціі полісом, при якому комплексантитіло - полісома преципітуючих з розчину додаванням другуантитіла, специфічного до першого. В якості другого антитіла найчастішеберуть фіксовані формаліном клітини Staphilococcus aureus, на поверхніяких знаходиться так званий білок А, що має спорідненість до Fc-фрагментів
Ig. З полісом, отриманих одним з описаних способів, далі вже виділяютьмРНК.
Інший шлях виділення індивідуальних мРНК базується на властивості мРНКвзаємодіяти з комплементарними ДНК, пов'язаними з твердим носієм
(целюлоза, сефароза, нітроцелюлозні фільтри). Цей метод відбору таочищення специфічних мРНК є найефективнішим. Однак йогозастосування можливо тільки за наявності відповідних комплементарних ДНК.
Отримання препарату очищеної мРНК дозволяє перейти до робіт зсинтезу гена за допомогою зворотної транскрипції, яку здійснюють здопомогою ревертази AMV у спеціально підібраних умовах. У процесізворотної транскрипції матрицею служить мРНК, а затравкою оліго (dT12-18) (длямРНК, що мають полі (А)-тракт) або хімічно синтезований олігонуклеотиди,комплементарний 3'-кінця мРНК. Після синтезу на мРНК комплементарної ланцюга
Руйнування ДНК і РНК (частіше використовується обробка лугом) здійснюютьсинтез другого ланцюга ДНК. У цій реакції матрицею служить перший ланцюг ДНК.
Реакція може каталізувати як ревертазой, так і ДНК-полімеразою.
Після отримання дволанцюжкової Комплементарна ДНК слід стадія отримання гена,що полягає в гідролізі одноланцюжкові ділянки ДНК, що з'єднує першіі другого ланцюга, Нуклеази S1.
Для отримання необхідних ділянок РНК використовують дві групи способів:
1) розщеплення полірібонуклеотідной ланцюга РНК в заданому місці; 2) синтез
РНК (ферментативний на ДНК-або РНК-матрицях і хімічний).
Розщеплення полірібонуклеотідной ланцюга РНК може здійснюватися вприсутності різних ферментів. Для цієї мети використовують ферменти:рибонуклеазу H, Нуклеази, ковалентно пов'язані з олігонуклеотиди
(наприклад, стафілококова Нуклеази), рібозіми (наприклад, Рибозим L-19).
Історично першим способом спрямованої ферментативної фрагментації
РНК (званої також адресованої, сайт-спрямованої або сайт -специфічної фрагментацією РНК) є розроблений в Московськомууніверситеті метод гідролізу РНК ферментом РНКази H в присутностікомплементарних олігодезоксірібонуклеотідов. Цей метод до цих пір залишаєтьсянайбільш універсальним способом спрямованої фрагментації РНК.
Метод заснований на властивості РНКази Н розщеплювати полірібонуклеотіднуюланцюг РНК у складі ДНК-РНК-гетеродуплекса. До ділянки РНК, за якимпланується провести її фрагментацію, синтезується комплементарнийолігодезоксірібонуклеотід довжиною в 6-10 нуклеотидних залишків. Даліотримують комплекс цього олігонуклеотиди з РНК, який потім обробляютьферментом. У роботі звичайно використовують РНКази Н з Escherichia coli - цілкомдоступний фермент, який може бути досить легко очищений від усіхсупутніх нуклеазних домішок. Цей метод знайшов досить широкезастосування для сайт-специфічного розщеплення вірусних і Хвороби, атакож для ідентифікації продуктів процесингу деяких РНК.
Важливим достоїнством розглянутого методу є й те, що врезультаті гідролізу РНК рибонуклеазу Н утворюються фрагменти, в одного зяких на 5'-кінці міститься фосфатна група, а в іншого 3'-кінецьвільний (нефосфорілірован). Такі фрагменти можна прямо використовувати вреакції ферментативного лигирование.
Серйозним обмеженням цього методу є те, що ділянка РНК, зяким зв'язується комплементарний йому олігодезоксірібонуклеотід, повиненмати однотяжевую конформацію і знаходитися на поверхні макромолекули
РНК, що є в умовах розщеплення компактну глобул зрозвиненою вторинної структурою. В окремих випадках це обмеження вдаєтьсяподолати, використовуючи досить довгі олігодезоксірібонуклеотіди (15-20 --членні), які попередньо отжигают з частково або повністюденатурований РНК.
Інше обмеження методу фрагментації полірібонуклеотідов РНКази Н вприсутності комплементарних олігодезоксірібонуклеотідов полягає в тому,що в загальному випадку передбачити, яка з фосфодіефірних зв'язків угетеродуплексе (або в безпосередній близькості від нього) піддастьсярозщепленню, не вдається. Більш того, фермент часто гідролізують не одну,а кілька сусідніх межнуклеотідних зв'язків. Ясно, що для подальшогоконструювання рекомбінантних РНК такі фрагменти можуть виявитисянепридатними.
Розщеплення РНК може проводитися і за участю Нуклеази, ковалентнопов'язаних з олігонуклеотиди. Ідея, що лежить в основі даного підходу доспрямованої фрагментації РНК, сходить до кінця 60-х років, коли Н. І.
Гриньовою і її співробітниками був запропонований метод олігонуклеотиди-що спрямовуєтьсямодифікації нуклеїнових кислот. Принцип цього методу полягає в тому, щоз 5'-або 3'-кінцевим залишком олігонуклеотиди, комплементарного заданомурайону ДНК і РНК, пов'язують модифікуючих агент, який після утвореннядуплексу атакує одне з найближчих до нього підстав. Реагентами цього типувдалося направлено фрагментувати фенілаланіновую тРНК з дріжджів, РНК -компонент (M1 РНК) РНКази Р, а також 16S Хвороби E.coli.
Однак, як і у випадку РНКази Н, розщеплення РНК олігонуклеотиди -Нуклеази часто проходить по декількох межнуклеотідним зв'язків, щодекілька обмежує можливості застосування цього методу для отриманнярекомбінантних РНК.
Для розщеплення РНК застосовують також рібозіми (природні РНК тасинтетичні полірібонуклеотіди, здатні каталізувати цілий рядперетворень у інших РНК). Перший Рибозим, що нагадує за своїми властивостямиендонуклеази рестрикції, був отриманий Т. Чеком. У науковій літературі йогопозначають як Рибозим L-19. Цей Рибозим являє собою РНК довжиною в
395 нуклеотидних залишків, в 5'-кінцевий області якої єгексануклеотідная послідовність GGAGGG, відповідальна за специфічністьрозщеплення попередника 26S РНК при самосплайсінге. Цяпослідовність комплементарна CUCUCU послідовності, розташованоїна 3'-кінці першого екзонів ділянки попередника 26S РНК. Якщо цю РНКзамінити іншою, але обов'язково містить доступну для комплементарногозв'язування CUCUCUA послідовність, то Рибозим L-19 у присутностігуанозіна або гуанілова нуклеотидів з вільною 3'-гідроксильної групоюрозщепити її.
Джерелом необхідних ділянок РНК може служити такий спосіб, яксинтез фрагментів РНК. Ферментативний синтез сегментів РНК здійснюють звикористанням різноманітних генно-інженерних конструкцій. Однак уданий час в переважній більшості випадків для препаративноїотримання РНК використовуються РНК-полімерази, закодовані в геномах ряду
ДНК-вмісних бактеріофагів (Т3, Т7 і SP6). Вони характеризуються дужевисокою активністю і, на відміну від клітинних РНК-полімерази, складаються зоднієї поліпептидного ланцюга. Важливо також те, що ініціація і термінаціїсинтезу РНК цими полімераза відбувається на одному певномунуклеотидної залишку.
Отримані одним із способів фрагменти нуклеїнових кислот у подальшомувбудовують в векторні молекули.
Підбиваючи підсумок викладеного, можна зробити висновок, що отримання генівпротективного білків збудників являє собою досить складнузавдання. Проте її рішення необхідно для створення в кінцевому рахункурекомбінантних противірусних вакцинних препаратів.
1.2. ВИБІР високоактивних і добре вивчених В
ІМУНОЛОГІЧНА СТОСОВНО моделі Вектор-носії та КЛОНУВАННЯ
ВІДПОВІДНОГО Гена
1.2.1. ОТРИМАННЯ рекомбінантної ДНК
Суть конструювання рекомбінантних ДНК полягає у вбудовуванніфрагментів ДНК, серед яких знаходиться цікавить нас ділянка ДНК, у такзвані векторні молекули ДНК (або просто вектори) - плазмідні абовірусні ДНК, які можуть бути перенесені в клітини про-або еукаріотів ітам автономно реплі-царювати. На наступному етапі проводиться відбір тихклітин, які несуть в собі рекомбінантні ДНК (за допомогою маркернихознак, якими володіє сам вектор), і потім індивідуальних клонів зщо цікавлять нас сегментом ДНК (використовуючи ознаки чи проби, специфічнідля даного гена або ділянки ДНК).
При вирішенні ряду наукових і біотехнологічних завдань конструюваннярекомбінантних ДНК вимагає також створення систем, в яких забезпечуєтьсямаксимальна експресія клонують гена.
Існує три основних способи вбудовування чужорідної ДНК у векторнімолекули. У першому випадку 3'-кінці фрагментів ДНК, серед яких находітсящо нас цікавить ділянка ДНК (ген або його сегмент, регуляторний район), здопомогою ферменту термінальної нуклеотіділтрансферази нарощуютьсягомополінуклеотідной послідовністю (наприклад, полі (Т)). 3'-кінцілінійної форми векторної ДНК тим же способом нарощуються комплементарноїїй гомополінуклеотідной послідовністю (тобто полі (А)). Цедозволяє з'єднати дві молекули ДНК шляхом комплементарного спаровуванняштучно отриманих "липких" кінців.
У другому випадку "липкі" кінці створюються за допомогою розщепленнямолекул ДНК (як векторної, так і містить цікавить нас фрагмент)однією з ендонуклеаз рестрикції (рестріктаз). Рестріктази характеризуютьсявинятково високою специфічністю. Вони "дізнаються" в ДНК послідовністьз декількох нуклеотидних залишків і розщеплюють в них строго певнімежнуклеотідние зв'язку. Тому навіть в ДНК великих розмірів рестріктазивносять обмежене число розривів.
Третій спосіб є комбінацією двох перших, коли липкікінці ДНК, утворені рестріктазой, подовжуються синтетичнимипослідовностями (рис. 1).
Кінці фрагментів ДНК можна перетворити на "липкі", нарощуючи їхдвутяжевимі олігонуклеотиди ( "лінкерами"), до складу яких входитьділянка пізнавання рестрікта-
Малюнок 1. Схема конструювання рекомбінантних ДНК за допомогою рестріктаз
PstI та полі (G) - полі (С)-лінкера.
Зої. Обробка такого фрагмента даної рестріктазой робить його придатнимдля вбудовування в векторну молекулу ДНК, розщепленню тієї ж рестріктаеой.
Часто як "лінкера" застосовуються полінуклеотидних фрагменти, якімістять специфічні ділянки відразу для декількох рестріктаз (їх називають
"полілінкерамі ").
Після вбудовування чужорідної ДНК у вектор їх ковалентного зшиванняздійснюється ДНК-лігази. Якщо ж розмір проломи в рекомбінуватимолекулі перевищує одну фосфодіефірную зв'язок, вона забудовується in vitro здопомогою ДНК-полімерази або in vivo за допомогою репаруючу систем клітини.
1.2.2. ОТРИМАННЯ Рекомбінантні РНК
Отримання рекомбінантних РНК звичайно здійснюють методамиферментативного або хімічного лигирование РНК. Крім того, нещодавноз'явилася принципово нова можливість вбудовування сегмента РНК узадане положення інших молекул РНК за допомогою рібозімов.
Ковалентні зшивання окремих сегментів РНК при отриманнірекомбінантних молекул, як правило, здійснюють за допомогою Т4 РНК-лігази.
Т4 РНК-лігази закодована в геномі бактеріофага Т4. Її виділяють з клітин
E.coli, заражених цим фагом. Фермент зшиває один з одним однотяжевиеоліго-і полірібонуклеотіди. Для роботи Т4 РНК-лігази необхідне джерелоенергії - аденозинтрифосфат. На рис. 2 наведена схема ферментативноголигирование двох коротких олігонуклеотиди. Як видно з цієї схеми,акцептором в реакції лигирование служить повністю дефосфорілірованний, адонором - повністю фосфорілірованний по кінцевим нуклеотидних залишкахолігонуклеотиди. Це запобігає можливість зшивання однотипнихолігонуклеотиди.
Ефективність ферментативного лигирование досить довгихполірібонуклеотідов сильно варіює і її важко передбачити виходячи тількиз нуклеотидної послідовності сегментів РНК. Найкращі результатиотримані в тих випадках, коли зшиваємо кінці полірібонуклеотідов булипросторово зближені за рахунок комплементарного зв'язування сусідніх зними ділянок РНК.
Нещодавно було встановлено, що протяжні сегменти РНК (довжиною в 200 -
300 залишків) можуть бути з високим виходом зшиті Т4 ДНК-лігази. При цьому
"стикування" сегментів здійснюється за допомогою олігодезоксірібонуклеотіда,комплементарного 3'-кінця одного сегменту і 5'-кінця іншого.
Метод хімічного лигирование заснований на активації кінцевий фосфатноїгрупи одного з двох зшиваємо сегментів РНК водорозчиннимкарбодіімідом або
Малюнок 2. Схема зшивання двох олігорібонуклеотідов за допомогою Т4 РНК-лігази.
BrCN. У разі BrCN реакція протікає дуже швидко і не супроводжуєтьсямодифікацією нуклеотидних залишків, хоча під дією карбодіімідовфосфодіефірная зв'язок утворюється з більш високим виходом. Для того, щобзабезпечити зближеного зшиваємо кінцевих нуклеотидних залишків уфрагментах РНК, було запропоновано використовувати олігодезоксірібонуклеотіди,комплементарні обом фрагментами в місці їх стику.
Хімічне лигирование РНК, як правило, проходить з істотноменшим виходом, ніж ферментативне. Однак воно дозволяє отримуватирекомбінантні РНК з незвичайними типами межнуклеотідной зв'язку (наприклад,пірофосфатной) і незвичайними нуклеотидними залишками в місці стику двохфрагментів.
Отримання рекомбінантних РНК за допомогою рібозімов засноване наоборотності реакції самосплайсінга (за відсутності гуанозіна або гуаніловануклеотидів). Це надає можливість для вбудовування інтронів РНК узадану ділянку іншого сегменту РНК (рис. 3). Фрагмент РНК, в якийпроводиться вбудовування, повинен містити нуклеотидну послідовність,ідентичну нуклеотидної послідовності 3'-кінцевого ділянки 5'-екзонів району 26S РНК і відповідно комплементарних тієї нуклеотидноїпослідовності в інтрони, яка відповідає за специфічність прямоїреакції. Фрагмент, в який виробляється вбудовування, береться у надлишку.
В даний час описана тут ланцюг реакцій може бути реалізованатільки для інтронів РНК, що отримується з попередника 26S РНКтетрахімени. Проте можна думати, що конструювання нових рібозімов можеістотно розширити можливості цього підходу.
1.2.3. СТРАТЕГІЯ КЛОНУВАННЯ Генов
Векторні молекули в обов'язковому порядку містять маркерні гени,які після перенесення вектора в клітини-реципієнти повідомляють їм новівластивості. Це може бути стійкість до антибіотика, якій дотрансформації клітини не володіли, або утворення ферменту, синтез якогов клітинах-реципієнтах не відбувався. Завдяки таким знову придбанимознаками клітини з векторними ДНК можуть бути легко знайдені в популяціївихідних клітин. Одночасно можуть бути відібрані ті клітини, якімістять вектори з вбудованими в них чужорідними ДНК (рекомбінантні ДНК).
Для цього вбудовування чужорідної ДНК у вектор проводиться таким чином,щоб один з маркерних ознак вектора порушувався. Так, наприклад, якщобактеріальний вектор несе стійкість до двох антибіотиків, то чужорідну
ДНК вбудовують в один
Малюнок 3. Схема прямого і оберненого процесу самосплайсінга.
з генів антибіотичною стійкості. І тоді бактерії з рекомбінантної
ДНК, на відміну від бактерій з вихідним вектором, можуть рости у присутностітільки одного з антибіотиків.
Інший дуже поширений приклад пов'язаний з наявністю в векторної
ДНК разом з генами, які повідомляють клітці стійкість до антибіотиків,фрагмента лактозною Оперон, що забезпечує утворення в клітинах -реципієнтах активного ферменту (-галактозидаза. Колонії клітин з такимознакою легко виявляються при вирощуванні їх на твердому агарі,що містить в якості субстрату (-галактозидаза 5-бром-4-хлор-3-індол-(--галактозид (X-gal), оскільки його розщеплення призводить до утвореннябромхлоріндола - барвника, пофарбованого у блакитний колір. Якщо ж в ген (--галактозидаза цього вектора вбудована чужорідна ДНК таким чином, що цейген виявився порушеним, то їм трансформовані клітини будуть утворюватибезбарвні колонії. Саме ж присутність рекомбінантного вектора в клітинахможе бути зафіксовано за їх стійкості до антибіотика.
На наступному етапі серед популяції клітин з рекомбінантними вектораминеобхідно відібрати індивідуальні клони, що містять тільки цікавлятьнас гени або їх фрагменти. Само собою зрозуміло, що це в принципіможливо тільки в тому випадку, якщо у вихідні клітини проникло в середньому поодній молекулі рекомбінантної ДНК. Спосіб же відбору клонів значноюмірі залежить від природи клонують гена.
Мабуть, найбільш простим є випадок, коли клонують генздатний комплементіровать ауксотрофную мутацію в штамі-реципієнті. У цьомувипадку клітини висіваються на середу, позбавлену речовини, необхідного длязростання даного штаму, і тільки клітини, що містить рекомбінантний ДНК зшуканим геном, здатні рости на цьому середовищі. З таких клонів отримуютьгомогенну культуру клітин, яку використовують для отримання шуканогосегмента ДНК, роблячи всі операції в зворотному порядку (тобто з клітинвиділяють вектор, з нього виокремлює необхідний фрагмент ДНК і так далі).
Набагато частіше для відбору необхідних клонів доводиться вдаватися дометодом ДНК-ДНК-або ДНК-РНК-гібридизації. Для цього необхідно мати у своєму розпорядженні
"зондами" (індивідуальними молекулами ДНК або РНК або їх фрагментами),комплементарними нуклеотидної послідовності клонують гена. Цеможуть бути спеціально синтезовані олігодезоксірібонуклеотіди довжиною в
15-20 залишків, послідовність яких обрана на підставі повністюабо частково відомої первинної структури гена або закодованого в ньомубілка. Це можуть бути Комплементарна ДНК, синтезовані на індивідуальних РНК-копіяхданого гена (як такі або у вигляді отклонірованних, тобто істотнопомножених в кількості фрагментів ДНК). Нарешті, це можуть бути самііндивідуальні РНК, закодовані в даному гені. Ясно, що у всіх випадках
"зонди" повинні нести радіоактивну мітку (зазвичай 32Р) з досить високоюпитомою активністю.
Якщо ж індивідуальний "зонд" недоступний, то застосовують методи, якіз великого числа рекомбінантов (106) дозволяють вибрати порівняноневелику групу (близько 102), що включає рекомбінант з потрібним геном. Цягрупа поділяється на підгрупи (наприклад, на 10) за 10 рекомбінантов.
З кожної підгрупи виділяється ДНК, яку використовують для синтезу мРНК іподальшої трансляції її з метою виявлення відповідного продуктушуканого гена.
Трансляція мРНК може бути здійснена в безклітинних системі. Однаку разі еукаріотичних генів мРНК часто переносять у ооцити жаби
(ксенопуса) за допомогою техніки мікроін'єкції, де вона транслюється. Продукттрансляції зазвичай виявляють за допомогою антитіл.
Далі в підгрупі, де виявлено шуканий ген, тим же методомдосліджується кожен клон.
При наявності зонда з чашки Петрі, на якій вирощені колонії клітин,робиться відбиток (репліка) на нітроцелюлозні фільтрі. Клітини даютьвирости на фільтрі, потім їх руйнують, піддають ДНК лужної денатураціїі фільтр прогрівають при 80 ° С, після чого ДНК необоротно з ним зв'язується.
Фільтр відмивають від домішок і обробляють радіоактивним "зондом" вумовах, оптимальних для ДНК-ДНК-або ДНК-РНК-гібридизації. Після видаленнянадлишку "зонда" методом ауторадіографія визначають положення клітинногоклону, що містить ділянку ДНК з нуклеотидної послідовністю,комплементарної "зонду". Цей клон стає потім джерелом клітин дляотримання шуканого гена або його фрагмента.
Для селекції клонів, які несуть необхідну ген, досить широкозастосовуються та імунологічні методи. Принцип відбору на перших етапах тойж, що і при використанні ДНК-і РНК-зондів. Далі з колоній зрекомбінантними ДНК робиться репліка за допомогою полімерної платівки, наякої закріплені антитіла до продукту шуканого гена. Положення клонів,що виробляють цей білок, визначається також з допомогою антитіл, але вжемічених радіоактивним йодом (125I).
1.2.4. РІЗНОМАНІТТЯ ВЕКТОРНА МОЛЕКУЛИ
Під поняттям "вектор" розуміється молекула нуклеїнової кислоти,здатна після введення в клітку до автономного існування за рахунокнаявності в ній сигналів реплікації і транскрипції.
Векторні молекули повинні мати наступні властивості:
1) здатністю автономно реплікуватись в клстке-реципієнті, тобтобути самостійним репліконом;
2) містити один або кілька маркерних генів, завдяки експресіїяких у клітини-реципієнта з'являються нові ознаки, що дозволяють відрізнититрансформовані клітини від вихідних;
3) містити по одному або, найбільше, по дві ділянки (сайту) длярізних рестріктаз в різних районах (у тому числі у складі маркернихгенів), але не в області, відповідальної за їх реплікацію.
В залежності від цілей експерименту вектори можна умовно розділити надві групи: 1) що використовуються для клонування і ампліфікації потрібного гена;
2) спеціалізовані, що застосовуються для експресії вбудованих чужоріднихгенів. Друга група векторів об'єднує вектори, покликані забезпечитисинтез білкових продуктів клонованих генів. Вектори для експресіїмістять послідовності ДНК, які необхідні для транскрипціїклонованих копій генів і трансляції їх мРНК в штамах клітин.
Як прокаріотів векторів використовуються плазміди,бактеріофаги; як еукаріотичних векторів застосовують віруси тварині рослин, вектори на основі 2 мкм дріжджів і мітохондрій і рядштучно сконструйованих векторів, здатних реплікуватись як убактеріальних, так і в клітині (човникові вектори).
Плазміди - це позахромосомних генетичні елементи про-і еукаріотів,які автономно реплікуються в клітинах. Більшість плазмідних векторівотримано на основі природних плазмід ColE1, pMB1 і p15A.
Бактеріальні плазміди поділяють на два класи. Одні плазміди (наприклад,добре вивчений фактор F, що визначає стать у E.coli) самі здатніпереходити з клітини в клітину, інші такою здатністю не володіють. Заряду причин, і перш за все для запобігання неконтрольованогорозповсюдження потенційно небезпечного генетичного матеріалу, переважнабільшість бактеріальних плазмідних векторів створено на базі плазміддругого класу. Багато природних плазміди вже містять гени, що визначаютьстійкість клітин до антибіотиків (продукти цих генів - ферменти,модифікують або розщеплюють антибіотичні речовини). Крім того, вці плазміди при конструюванні векторів вводяться додаткові гени,визначають стійкість до інших антибіотиків.
На рис. 4 показаний один з найпоширеніших плазмідних векторів
E.coli - pBR322. Він сконструйований на базі детально вивченої плазміди
E.coli - коліціногенного фактора ColE1 - і містить оріджін реплікації цієїплазміди. Особливість плазміди ColE1 (і pBR322 відповідно) полягає вте, що в присутності інгібітора синтезу білка антибіотика хлорамфеніколу
(опосередковано інгібуючої реплікацію хазяйської хромосоми) її число в
E.coli зростає від 20-50 до 1000 молекул на клітину, що дозволяєотримувати великі кількості клонують гена. При конструюванні вектораpBR322 з вихідних плазмід був делегований цілий ряд "зайвих" сайтів длярестріктаз.
В даний час разом з безліччю зручних векторних систем для
E.coli сконструйовані плазмідні вектори для ряду інших грамнегативнихбактерій (у тому числі таких промислово важливих, як Pseudomonas, Rhizobiumі Azotobacter), грампозитивних бактерій (Bacillus), нижчих грибів
(дріжджі) і рослин.
плазмідні вектори зручні для клонування відносно невеликихфрагментів (до 10 тис. пар основ) геномів невеликих розмірів. Якщо жпотрібно отримати клонотеку (або бібліотеку) генів вищих рослин ітварин, загальна довжина геному яких досягає величезних розмірів, тозвичайні плазмідні вектори для цих цілей непридатні. Проблему створеннябібліотек генів для вищих еукаріотів вдалося вирішити з використанням вяк клонують векторів похідних бактеріофага (.
Серед фагів векторів найбільш зручні системи були створені на базігеномів бактеріофагів (і М13 E.coli. ДНК цих фагів містить протяжніобласті, які можна делегувати або замінити на чужорідну ДНК, незачіпаючи їх здатності реплікуватись в клітинах E.coli. Приконструюванні сімейства векторів на базі ДНК (фага з неї спочатку (шляхомподілок коротких ділянок ДНК) були видалені багато сайтів рестрикції зобласті, не істотною для реплікації ДНК, і залишені такі сайти вобласті, призначеної для вбудовування чужорідної ДНК. У цю ж областьчасто вбудовують маркерні гени, які дозволяють відрізнити рекомбінантний ДНК відвихідного вектора. Такі вектори широко використовуються для одержання
"бібліотек генів". Розміри заміщає фрагмента фагової ДНК івідповідно вбудованого ділянки чужорідної ДНК обмежені 15-17 тис.нуклеотидних залишків, так як рекомбінантний Фаго -
Малюнок4. Детальна рестрикційних карта плазміди pBR322.
вий геном, який на 10% більше або на 75% менше геному дикого (фага,вже не може бути упакований в фагів частинки.
Таких обмежень теоретично не існує для векторів,сконструйованих на базі нитчастих бактеріофага М13. Описано випадки, колив геном цього фага була вбудована чужорідна ДНК довжиною близько 40 тис.нуклеотидних залишків. Відомо, однак, що фаг М13 стаєнестабільним, коли довжина чужорідної ДНК перевищує 5 тис. нуклеотиднихзалишків. Фактично ж вектори, отримані з ДНК фага М13, використовуютьсяголовним чином для секвенування і мутагенезу генів, і розміривмонтованих в них фрагментів набагато менше.
Ці вектори конструюються з реплекатівной (двутяжевой) форми ДНКфага М13, в яку вбудовані "полілінкерние" ділянки (приклад такоїконструкції показано на рис. 5). У фагів частку ДНК включається у виглядіоднотяжевой молекули. Таким чином, цей вектор дозволяє отримуватиклонований ген або його фрагмент як у двутяжевой, так і в однотяжевойформі. Однотяжевие форми рекомбінантних ДНК широко використовуються в данийчас при визначенні нуклеотидної послідовності ДНК методом Сенгераі для олігодезоксінуклеотід-спрямованого мутагенезу генів.
Перенесення чужорідних генів у клітини тварин здійснюється за допомогоювекторів, отриманих з ДНК ряду добре вивчених вірусів тварин - SV40,деяких аденовірусів, вірусу папіломи бика, вірусу віспи і так далі.
Конструювання цих векторів проводиться за стандартною схемою: видалення
"зайвих" сайтів для рестріктаз, введення маркерних генів в області ДНК, неістотні для її реплікації (наприклад, гена тимідину-кінази (tk) з HSV
(вірусу герпесу)), запровадження регуляторних районів, що підвищують рівеньекспресії генів.
Зручними виявилися так звані "човникові вектори", здатніреплікуватись як у клітинах тварин, так і в клітинах бактерій. Їхотримують, зшиваючи один з одним великі сегменти векторів тварин ібактерій (наприклад, SV40 і pBR322) так, щоб райони, відповідальні зареплікації ДНК, залишилися незачепленими. Це дозволяє проводити основніоперації з конструювання вектора в бактеріальної клітці (що технічнонабагато простіше), а потім отриману рекомбінантний ДНК використовувати дляклонування генів у тваринній клітині.
Малюнок 5. Рестрикційних карта вектора М13 mp8.
1.3. ВИБІР система експрес Клонований
гена, ЗДАТНОЇ ЗАБЕЗПЕЧИТИ МАКСИМАЛЬНИЙ ВИХІД І
ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ повноцінний продукт
Отримані рекомбінантні молекули переносяться в певні групиклітин, які мають забезпечити експресію цих генів, тобто синтезвідповідних білків у кількостях, економічно рентабельних попорівнянні зі звичайною технологією їх виробництва.
Зазвичай для цієї мети використовують бактеріальні або дріжджові культуриклітин, а також системи експресії на основі еукаріотів.
З бактеріальних клітин найбільш вивченої в молекулярно-генетичномувідношенні є грамотрі
