ЗМІСТ

Введення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3
1. Визначення нуклеотидної послідовності модифікованим методом
Максама і Гілберта ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .4
2. Секвенування ДНК методом полімеразної копіювання (метод Сенгера)
... ... ... ... 8
3. Філогенетичний аналіз геномів вірусів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 15
4. Комп'ютерний аналіз генетичних текстів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 18
Висновок ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 22
Список літератури ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .23

ВСТУП.

Розробка методів клонування і визначення послідовностіпідстав (секвенування) нуклеїнових кислот поклала початок новому етапу розвитку молекулярної біології. Знання первинної структури ділянокгеному, що виконують певні функції, дало можливість ефективнозастосувати для їх дослідження цілий арсенал нових методів генної інженерії.
Ці методи (спрямований мутагенезу, рекомбінація in vitro та ін)дозволяють модифіковані ділянки нуклеотидних послідовностей ідосліджувати їх функції на молекулярному рівні. З їх допомогою комбінуютьсяділянки генетичного матеріалу і створюються геноми з абсолютно новимифункціями.

Секвенування нуклеїнових кислот в даний час стало рутиннимметодом молекулярної біології. Поза сумнівом, в найближчому майбутньому з'являться щебільш досконалі автоматичні секвенатори, що призведе до різкогозбільшенню числа розшифрованих послідовностей.

Завдяки знанню генетичного коду з'явилася можливість визначатиділянки нуклеотидних послідовностей, які кодують потенційні білки.
Це джерело і сьогодні дає нам основну інформацію про функціональнебудові нуклеотидної послідовності.

1. ВИЗНАЧЕННЯ нуклеотидну послідовність модифікований метод

МАКСАМА І Гілберта.

Швидкий прогрес, що спостерігався в останні роки в різних областяхмолекулярної біології, багато в чому обумовлене появою ефективного методувизначення первинної структури ДНК. Цей метод, запропонований у 1977 р.
Максамом і Гілбертом, заснований на селективної хімічної модифікаціїрізних типів гетероциклічних основ у складі ДНК з подальшимрозщепленням межнуклеотідних зв'язків у модифікованих ланках. Реакціїселективної модифікації по кожному типу гетероциклічних підставпроводяться таким чином, щоб у кожній молекулі ДНК у середньомумодифікувалися тільки одна ланка даного типу. Оскільки всі ланкиданого типу в складі молекули еквівалентні і реагують з модифікуєагентом з однаковими швидкостями, то в сумі кожна ланка цього типувиявиться частково модифікованим. Подальша обробка ДНК вториннимаміном або лугом приводить до відщеплення модифікованих гетероциклічнихпідстав від ланцюга ДНК і розриву полінуклеотидних ланцюга в місцях відщепленнягетероциклів (рис. 1).

Модифікації піддають ДНК, 32Р-мічені по 5'-кінцевому нуклеотидноїланці. Радіоактивна мітка вводиться фосфорилюванням за допомогою-32Р-
АТР і Т4-полінуклеотідкінази. Таким чином, в результаті хімічноїдеградації виходить набір фрагментів ДНК різної довжини. Довжини цихфрагментів відповідають положенню мономірних ланок того типу, якийпіддавався модифікації. Кінцева радіоактивна мітка служить точкою відлікупри визначенні довжини продуктів хімічної деградації ДНК (рис. 2)

Набір отриманих фрагментів фракціоніруется електрофорезом в ПААГ,який дозволяє розділяти оліго (поли) нуклеотиди, що відрізняються по довжинівсього на одне мономірні ланка. Послідовність нуклеотидів в ДНКчитається безпосередньо з радіоавтографа гелю.

Метод Максама і Гілберта, розроблений для аналізу первинноїструктури досить довгих ДНК, застосовний і для коротких (8 - 16 ланки)оли-годезоксірібонуклеотідов. Однак у цьому випадку реакції хімічноїмодифікації проводять в більш жорстких умовах (збільшуючи час ітемпературу реакції) з метою підвищення ступеня модифікації.

Малюнок 1.1 відщеплення модифікованих ланок від ланцюга ДНК після обробки вторинним аміном або лугом.

< p> Малюнок 2 Хімічна деградація ДНК.

Набір реакцій, що застосовуються для розщеплення ДНК по мономерних ланокпевного типу досить великий і постійно поповнюється: по залишкахгуаніну - обробка діметілсульфатом (мал. 3); по залишках аденіну тагуаніну - апурінізація 50%-ної мурашиної кислотою (по Бартон); позалишках аденіну та цитозину - розщеплення гетероциклічних основ піддією 1,2 н. гідроксиду натрію і по залишках тимідину і цитозину --обробка гідразину (рис. 4).

В даний час широко використовуються два основні варіантисеквенування по Максаму - Гілберт. У першому з них реакції хімічноїмодифікації ДНК проводять у розчині, а в другому ДНК попередньомобілізують на твердій фазі (наприклад, ДЕАЕ-целюлозі). Перший метод більшетрадиційний, його численні модифікації з успіхом використовувалися длясеквенування фрагментів ДНК різних розмірів, у тому числіолігонуклеотиди. У той же час другий метод має ряд переваг. Вінменш трудомісткий і займає менше часу, простіше в освоєнні, дозволяєобійтися мінімальним набором устаткування. У цілому обидва методи забезпечуютьотримання цілком прийнятних результатів, а вибір одного з них визначаєтьсяконкретними умовами лабораторії.

Малюнок 3 Реакція селективного розщеплення по залишках гуаніну

Малюнок 4 Реакція селективного розщеплення по залишках тимідину і цитозину.

2. Секвенування ДНК метод полімеразної КОПІЮВАННЯ.

(Секвенування ДНК)

ферментативний синтез оліго (поли) дезоксірібонуклеотідов за допомогою ДНК -полімерази, що полягає в копіюванні матричного полінуклеотіда знайшовблискуче застосування в якості одного з двох найбільш ефективних методіввстановлення первинної структури ДНК. Метод полягає в отриманні блоків -копій полідезоксірібонуклеотіда, структура якого вивчається. При цьомуобов'язковим є виконання двох умов. По-перше, копіюванняповинно проводитися, починаючи з певного мономірні ланки. По-друге,синтез копій слід здійснювати чотири рази, щоразу зупиняючи йогопо черзі на якому-небудь одному з чотирьох мономірних ланок (A, G, С або
Т), інакше кажучи, прагнуть отримати повний набір "комплементаціонновідображених "копій досліджуваного полінуклеотіда, утворення якихприпинилося в кожному з місць розташування одного з чотирьох мономірнихланок нуклеїнової кислоти. Визначення довжини кожної копії дозволяєвстановити положення даного мономірні ланки в ланцюзі досліджуваногополінуклеотіда. Довжина копії визначається фракціонування вполіакриламідному гелі. Цей метод, таким чином, так само як і метод,заснований на модифікації підстав дозволяє отримувати інформацію проположенні певного мономірні ланки в ланцюзі полінуклеотіда прямо післяфракціонування.

Для отримання копії досліджуваного полінуклеотіда в останньому вибираютьточку відліку, що досягається введенням в систему ферментативного синтезуяк нуклеозідних компонента олігонуклеотиди-затравки. Такийолігонуклеотиди в усіх копіях, що утворюються в результаті добудовування йогоферментативним шляхом, залишається постійним 5'-кінцевим фрагментом, тобтоє точкою відліку. Копіювання за допомогою ДНК-полімерази в присутностівсіх чотирьох дезоксірібонуклеозід-5'-пірофосфат (один з них береться
32Р-міченим) проводять протягом обмеженого часу. Мета цьогоетапу - проведення статистично обмеженого синтезу для отримання всіхможливих копій, починаючи з затравки, добудованій на одне, два і т. д.ланок, і включаючи повну копію вивчається полінуклеотіда. В ідеалі сумішповинна включати всі можливі полінуклеотіди (мал. 5), синтез якихстатистично припиняється десь в середині матричного полінуклеотіда врайоні ATGCTG матричної послідовності. На практиці різнікомпоненти суміші присутні в різних кількостях. Якщо таку суміш даліпіддати електрофорезу в поліакриламідному гелі в певних умовах,коли швидкість руху пропорційна довжині ланцюга, на електрофореграммевиявляється серія смуг, що представляють різні олігонуклеотиди. Такефракціонування зазвичай не проводять, хоча воно може використовуватисядля контролю на

Малюнок 5 Використання ферментативного синтезу оліго (поли) дезоксірібонуклеотідов для визначення первинної структури ДНК.

завершальному етапі аналізу. Інкубаційний суміш 32Р-міченихолігонуклеотиди різної довжини у вигляді комплексів з матричнимполінуклеотідом піддають гель-фільтрації для видаленнядезоксірібонуклеозід-5'-трифосфату і малих аліквотах реакційної сумішіреінкубіруют з ДНК-полімеразою в різних умовах. У разі "мінус -системи "реінкубацію проводять в присутності тільки трьохдезоксірібонуклеозід-5'-три-фосфатів. Наприклад, в «- А-системі» відсутняdATP і кожна копія в суміші добудовується за допомогою ДНК-полімерази домісця, в якому наступним мономірні ланкою повинен бути залишок pdA (тобто
Т в матричному полінуклеотіде). Утвориться суміш фракціоніруют за допомогоюелектрофорезу і виявляють (ауторадіографіческі) обмежена кількістьсмуг (їх кількість дорівнює кількості Т в матричному полінуклеотіде).
Аналогічно проводять копіювання за відсутності інших субстратів: - dGTP, --dCTP або - dTTP (- G-, - С-і - Т-системи відповідно). Всі чотириІонофорез проводять у поліакриламідному гелі паралельно. Отриманіауторадіограмми дозволяють відразу написати нуклеотидну послідовність,причому читання ланцюга знизу вгору відповідає 5'3'-полярності ланцюгакопії. Наприклад, положення самого короткого олігонуклеотиди (в "- Т -системі ") вказує на те, що наступний за ним по довжині олігонуклеотидизакінчується на Т, тобто що проти смуги, розташованої вище (це смугав - А-системі), слід записати букву Т. Таким же чином записуютьдалі в послідовності букву А (на підставі положення наступного задовжині олігонуклеотиди, який опинився в "- А-системі") і т. д.
Відповідний ділянку ланцюга в матриці читається з урахуванням принципукомплементарності і антипаралельних ланцюгів в комплексі матриця --запал. Для перевірки цих даних використовують результати аналізу за допомогою
"плюс-системи". У цьому випадку додаткове копіювання (після першогоетапу) проводять у присутності ДНК-полімерази, що виділена з бактеріофага
Т4, яка під час відсутності субстратів (нуклеозид-5'-трифосфату) проявляє
3'-екзонуклеазную активність (аналогічну дії ФДЕ зміїної отрути), тобтовідщеплює мононуклеотид один за одним з 3'-кінця. У той же час уприсутності субстратів її полімеразна активність у багато разів перевершуєекзонуклеазную. Так, якщо в реакційній суміші присутній хоча б одиндезоксірібонуклеозід-5'-трифосфат (dATP в "+ А-системі"), деградація кожнійкопії, що утворилася на першій стадії аналізу, проходитиме аж домісця положення А (Т в матриці). У цьому випадку pdA включається багатошвидше, ніж віддаляється, і, таким чином, накопичуються фрагменти,містять на 3'-кінці ланцюга А. Аналогічно проводять копіювання вприсутності тільки dGTP, dCTP або dTTP. Суміші паралельно піддаютьелектрофорезу, як і в попередньому випадку, і отримують ауторадіограмми, зяких відразу зчитується послідовність 5'3'-напрямок,зчитується також знизу вгору). З порівняння фореграмм "плюс-" і "мінус -систем "робиться однозначний висновок про нуклеотидної послідовності вкопіях і, отже, в матричному полінуклеотіде.

В даний час виділення фрагментів ДНК, створення рекомбінантнихгенів, а так само пряме секвенування ДНК і Комплементарна ДНК стають загальнодоступнимиметодами завдяки широкому впровадженню ПЦР (полімеразної ланцюговоїреакції). Сутність ПЛР полягає у використанні двох олігонуклеотиди -праймерів, здатних специфічно гібрідізоваться з послідовностяминуклеотидів на протилежних кінцях двох ланцюгів ділянки ДНК, якзатравки для одночасного синтезу комплементарних ланцюгів з протилежнихрешт матриці за допомогою термостабільної ДНК-полімерази. У ходіповторюваних циклів (температурної денатурації ДНК, відпалу таензиматичного добудови праймерів) експоненціально збільшуєтьсякількість дискретного фрагмента, фланковані послідовностяминуклеотидів, відповідних первинної структурі праймерів.

Застосування методу Сенгера залежить від можливості отриманняодноланцюжкові копій клонованих ДНК. Для цієї мети можна використовувативектори на основі бактеріофага М13. Дволанцюжкові чужорідну ДНК можнаклонувати в дволанцюжкової реплікативної формі (РФ) фагової ДНК, при цьомупісля трансформації в білкову оболонку буде упаковуватимуться тільки одна зланцюгів ДНК. У всіх векторах типу М13тр використовуються подібні полілінкерниепослідовності, тому для ініціації полімеразної реакцій придатнийодин і той самий універсальний праймер. При ампліфікації суміші генів
(наприклад, сімейства генів) необхідно провести клонування ПЛР-продуктівв векторах типу М13, в результаті кожен фаг буде містити лише однувставку. При прямому секвенування суміші генів спостерігається кількаоднаково розташованих смуг у різних доріжках гелю. При ампліфікації жодного гена можна проводити пряме секвенування, не вдаючись допроміжного субклонірованію.

Вибір оптимального праймера для ПЛР залежить від 5 '- і 3'-кінцевихпослідовностей ампліфіціруемого фрагмента ДНК. Крім того, длявстраивания ПЛР-продукту в полілінкерний сайт вектора М13 в 5'-кінецьпраймерів повинні бути включені відповідні рестрикційних сайти. У цьомувипадку ПЛР-ампліфікація з наступною рестриктазами продукту дозволитьпровести його вбудовування в ДНК М13, рестріцірованную тим самим ферментом. Урізні кінці ампліфіціруемого фрагмента краще включати сайти для різнихрестріктаз, оскільки це дозволить уникнути відпалу векторної ДНК самої насебе і забезпечить становище клонованим вставки в певній орієнтації
(так зване спрямоване клонування). При підборі праймерівнеобхідно враховувати наступні фактори. а. Слід переконатися в тому, що ампліфіціруемое сімейство генів немістить консервативного внутрішнього рестрикційних сайту, ідентичногосайту, включеного до праймер. б. Після включення рестрикційних сайту 5 '- кінець праймера потрібноподовжити, у противному випадку рестріктаза не буде розщеплювати праймер.
Необхідна для кожного ферменту довжина виступаючого ділянки і часрестрикції вказані в каталозі фірми New England BioLabs.

Перед секвенування дволанцюжкові рекомбінантний ДНК М13 необхідноперевести в одноланцюжкові форму. Для цього її вводять шляхом трансформації вкомпетентні клітини E. сoli. Бляшки, що містять одноланцюжковірекомбінантні фаги, необхідно виколоти, наростити в бактеріальноїкультурі і депротеінізований.

Потім переносять культуру в мікроцентріфужную пробірку на 1,5 мл іцентріфугіруют в мікроцентріфуге при 12 000 g протягом 5 хвилин. Переносять
1 мл супернатанта (містить чистий фаг) у другу пробірку на 1,5 мл,додають 200 мкл поліетиленгліколю і інкубують при кімнатній температуріяк мінімум 15 хвилин. Збирають фаг центрифугуванням протягом 5 хвилин при
12 000 g і відбирають супернатант. Швидко повторюють центрифугування іповністю видаляють всі сліди супернатанта. Потім беруть в облогу ДНК ацетатомнатрію, промивають її 70%-ним етанолом і висушують під вакуумом. Розчиняють
ДНК у 30 мкл води. Отримана ДНК є одноланцюжкові матрицюдля секвенування.

Нижче наведена конкретна методика секвенування:

Матеріали

• 5 х реакційний буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl

• Буфер для розведення ферменту: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ,
0,5 мг/мл БСА

• 5 х суміш для мічення: за 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP

• Суміш для ddG-термінації: за 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl

• Суміш для ddA-термінації: за 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl

• Суміш для ddC-термінації: за 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl

• Суміш для ddT-термінації: за 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl < p> • Стоп-розчин: 90% формамід, 20 мМ ЕДТА, 0,05% бромфеноловий синій,
0,05% ксілолціанол

• Універсальний праймер для секвенування - 40 (0,5 пмоль/мкл)

• [35S] dATPS (1 мКі/37 МБК в 100 мкл) (Amersham, UK; до складу набору не входить)

• 0,1 М ДТТ

Методика

Всі реактиви додають за допомогою диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600),сполученого з адаптером і шприцом 1710 з газовим затвором. Суміш длямічення попередньо розбавляють в п'ять разів.

1. Для кожної секвеніруемой матриці змішують в мікроцен-тріфужной пробірці на 1,5 мл для отримання праймерной суміші 6 мкл води, 1 мкл універсального праймера і 2 мкл реакційного буфера.

2. Розмічають мікроплашку Falcon 3911. У верхній її частині наносять номери клонів, а ліворуч, зверху вниз, - букви TCGA.

3. На дно кожного осередку наносять 2 мкл праймерной суміші, на бічні стінки - по 2 мкл розчину секвеніруемой матриці і центріфугіруют плашку.
Накривають її плівкою Saran ® і кришкою і поміщають у водяну баню з температурою 70 ° С на 5 хв. Охолоджують плашку на столі (за цей час відбувається отжиг праймера і ДНК М13).

4. Поки плашка охолоджується, готують суміш для мічення. Для цього в мікроцентріфужную пробірку на 1,5 мл вносять 0,5 мкл 35S-dATP, 1 мкл 0,1 М
ДТТ, 2 мкл розведеною суміші для мічення і 3,5 мкл води.

5. Розмічають полікарбонатну мікроплашку Techne 96 ® так само, як перше плашку, і в клітинки в ряді "Т" вносять по 2 мкл суміші для ddT-термінації. Аналогічним чином вносять суміш для термінації в комірки інших рядів і поміщають плашку в термостат для мікроплашек з температурою 42 ° С.

6. Після охолодження плашки (п. 3) протягом 30 хв додають до суміші для мічення (для кожної матриці) послідовно 1,77 мкл буферу для розведення ферменту і 0,22 мкл ферменту Sequenase ® II. (Це дозволяє тримати фермент Sequenase ® II не в холодильнику мінімальний час.)

7. По 2 мкл цієї суміші наносять на бічну стінку комірок, що містять праймерную суміш, і центріфугіруют плашку для перемішування компонентів.
Включають секундомір.

8. Через 2 хв починають переносити розчин з комірок першого плашки у відповідні поля попередньо нагрітій і вміщеній у термостат полікарбонатною плашки. Для цього використовують звичайну мікропіпетку, швидко змінюючи наконечники після кожної комірки (пам'ятайте, що використані наконечники радіоактивні).

9. Після того як перенесений розчин з останньої клітинки, включають секундомір і в наконечник на шприці Hamilton набирають стоп-розчин.

10. Через 5 хв наносять по 5 мкл стоп-розчину на бічну стінкукожного осередку і центріфугіруют плашку. Після центрифугування плашку,закриту кришкою, можна зберігати в морозилці до використання (при - 20 ° С
35S-продукти можна зберігати протягом тижня).

ампліфикувати послідовності нуклеотидів можна побачити в УФ -світлі після фракціонування продуктів ПЛР за допомогою гель-електрофорезувпрісутствіі бромистого етидій. У більшості випадків після ПЛР при наявності
1 - 10 нг ДНК-матриці виявляється тільки одна смуга ДНК очікуваноїелектрофоретичної рухливості. Чутливість і специфічність детекціїпродуктів ампліфікації значною збільшуються при використаннірізних варіантів ДНК-ДНК-гібридизації з олігонуклеотиди-зондами,мають радіоактивну біотіновую, флюоресцентна або хемолюмінесцентнуюпозначку. Це зробило можливим проведення робіт з мінімально можливимкількістю матеріалу, (наприклад, з одного кліткою, однією копією гена) безпопередньої його очищення.

За вихідну матриці для ПЛР може бути використана ДНК (абоКомплементарна ДНК, отримана за допомогою попередньої зворотної транскрипції РНК),виділена як із свежеполученних клітин і тканин, так і з заморожених,висушених або фіксованих препаратів, що мають частково деградованінуклеїнові кислоти, тобто об'єкти, раніше недоступні для аналізу. Так, здопомогою методів ПЛР була ампліфикувати, клонована і секвенувати ДНКєгипетської мумії, продемонстрована можливість аналізу специфічнихділянок ДНК при наявності однієї волосинки, клітини, сперматозоїда з метоюідентифікації особи і підлоги господаря.

серповидно-клітинна анемія,-таласемія, діабет, ревматоїднийартрит, м'язова дистрофія, фенілкетонурія, гемофілія, дефіцит --антитрипсину - ось далеко не повний список генетичних захворювань,які можуть бути виявлені на ранніх стадіях розвитку ембріона за допомогою
ПЛР Розроблено також підходи до раннього виявлення та прогнозуванняонкологічних захворювань.

3. Філогенетичне АНАЛІЗУ Геном вірусу.

філогенетичний аналіз молекулярних даних є одним зпідходів до теоретичного вивчення структури та функції генетичнихмакромолекул (РНК, ДНК, білків) та їх еволюційного перетворення. Основнамета філогенетичної аналізу - вивчення еволюційного порядку дивергенціїпослідовностей генів і білків або їхніх частин, а також відновленнясписків еволюційних подій (замін нуклеотидів, ділок і вставок) впредкової лініях цих макромолекул.

Основним інструментом філогенетичної аналізу є порівнянняблизьких за структурою або по функції генів або білків, і перш за все,порівняння їх первинних послідовностей.

Найважливішою властивістю функціонально значущих структур макромолекулє їх еволюційний консерватизм. Чим менше функціональна важливістьокремих ділянок генів, тим більше вони мають тенденцію до еволюційноїмінливості. Так, наприклад, псевдогени мабуть повністю втратилифункціональну активність. Для них характерне швидке накопичення в ходіеволюції різних замін, ділок і вставок, що руйнують вихідну структуругена. З іншого боку, гістони Н4, що грають важливу роль в упаковціхроматину, майже не змінювалися протягом всієї еволюції тварин.

Консервативність генів дозволяє виявити віддалене споріднення між їхнімипредставниками, давно розійшлися в ході еволюції і виконують інодірізні функції. Однак для філогенетичної аналізу необхідно і наявністьпевного рівня мінливості генів. Мутації, делеції та вставкиє свого роду позначками, завдяки яким вдається відновити шляхиеволюції сучасних форм макромолекул. Гени з різною величиноюконсервативності придатні для вивчення різних еволюційних рівнів. Сильноконсервативні гени та їх продукти (гістони, тРНК) не можна, наприклад,використовувати для дослідження еволюції загонів і більш дрібних таксонів, алез успіхом можна застосовувати для вивчення еволюції більш великих таксонів.
Сильно варіабельні гени, навпаки, дають хороше дозвіл лише на пізніхеволюційних етапах.

Останнім часом метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) зподальшим аналізом нуклеотидної послідовності широко використовуєтьсядля точної ідентифікації вірусів та визначення їх споріднення відносноінших штамів. Для порівняльної характеристики геномів різних штаміввірусів також проводять рестрикційних аналіз ПЛР-продуктів. Зазвичай дляпобудови філогенетичної дерева використовуються дані послідовностейнуклеїнових кислот. Філогенетичне дерево дуже ясно показує спорідненістьміж вірусами, якщо аналізується велика кількість ізолятів. Для цихцілей існує багато комп'ютерних програм. Найбільш популярні пакетипрограм-PHYLIP (PHYLogeny Inference Package), PAUP (Phylogentic Analysis
Using Parsimong), CLUSTAL і MEGA.

Для філогенетичної аналізу особливо цікаві РНК-содержатвіруси, які існують як гетерогенні популяції. Їх геном більшгенетично пластичний, ніж геном ДНК-вірусів.

Так, геном вірусу сказу, який відноситься до роду Lyssavirusсімейства Rhabdoviridae, представлений одноланцюжкові негативної РНК довжиноюблизько 12000 пар основ (П.О), що кодує п'ять основних білків.

Білки підрозділяються на три функціональні групи: оболочечные
(G, M) нуклеокапсідний (N) і РНК-полімеразної комплекс, що складається з L і NSбілків. Білки N, NS і L разом з віріонів РНК утворюють нуклеокапсид,який оточений мембраною, яка містить трансмембранний глікопротеїн G,відповідальний за антигенні властивості вірусу. Існування псевдогена (між G і L цистрон, є відмінною рисою вірусусказу від вірусу везикулярного стоматиту.

N-ген ліссавірусов, як показало клонування і секвенування,є найбільш консервативним за своєю структурою з усіх генів вірусусказу.

Mannen K.et al, у 1991 р. визначили велику залежністьвідмінностей в N-гені від географічної локалізації, ніж від хазяйськоїспецифічності. В Онтаріо вірус сказу, що описаний як єдиний
«Арктичний» тип, розділили на чотири основних типи. Ці типифилогенетично розгалужуються на дві основні гілки, одна з якихсостовляет один тип, другий три основні типи, що відображає історичнепересування вірусу в регіоні від середини до кінця 50-х рр.. Епізоотіяпересувалася на південь Онтаріо з півночі і Квебека. Зміни впослідовності N-гена, визначених для 4-х вірусних типів, можутьпредставляти генетичний маркер для більш істотних змін в іншихчастинах вірусного генома.

Kissi et al представили перший порівняння між генотипами імолекулярними відмінностями N-гена всередині першого генотипу. Філогенетичнийаналіз гена нуклеопротеїнів 82-х ліссавірусов підтвердив існування шестигенотипів ліссавірусов, і також виділив ізоляти сказу перший генотипув окремі генетичні лінії. Ізоляти з меншою ніж 80% нуклеотидної і
92% амінокислотної гомології відносяться до різних генотипу. Два короткихрегіону з 400 нуклеотидів, що кодують аміноконец N-протеїну, і 93нуклеотиду, що кодують N-NS-регіон, можуть бути використані для визначеннягеографічного розподілу основних вірусних ліній. Виявлено дварегіону, що мають найменший рівень гомології: ділянка довжиною 199 парпідстав (нуклеотиди від 1080-го до 1278-го) і більш протяжний фрагмент,розташований між 99-м і 405-м нуклеотидами. Філогенетичне деревопобудували, використовуючи пакет програм MEGA. З їх допомогою отримали дерево згілками, які діляться на 6 кластерів, які відповідають 6-ти генотипу.
Порівняння ізолятів показало, що в генетичному плані найбільш близькимиопинилися 4-й і 5-й генотипи, у яких рівень відмінностей склав 79,8%
(нуклеотидних рівень) і 93,3% (амінокислотний рівень) [Duvenhage virus
(4) і EBL1 (5)]. Всередині генотипу 1 найменшу схожість серед ізолятів з
Азії та Латинської Америки - 83,3%; і найбільшу подібність у изолята з
Африки та Латинської Америки - 92,2%.

філогенетичний аналіз ізолятів 1-го генотипу вірусу сказу.

Kissi et al. ідентифікували 11 філогенетичних ліній, взятихвідповідно до їх географічним походженням і видом господаря: Африка
1а, Африка 1в, Африка 2, 3 Африка, Азія, Арктика, Європа/Середній Схід,
Латинська Америка 1 і 2 і дві групи вакцинних штамів. Філогенетичнедерево будувалося на підставі порівняння фрагмента або цілого N-гена.

Цей аналіз дозволив більш точно визначити циркуляцію по зонахі встановити походження та розповсюдження сказу для деяких ліній,які, можливо, відбулися незалежно на цьому континенті від різнихпопередників. Хоча циркуляція африканських вірусів 1а і 1в більш відмінновід вірусів, поширених в Європі і Середньому Сході, проте булавиявлено генетичний зв'язок між ними, що свідчить про загальнийпращура.

З'ясовано, що накопичення більшості нейтральних мутацій угеографічно розділених вірусних популяціях призвело до значнихрозбіжностей у нуклеотидної послідовності гена нуклеопротеїнів.

При дослідженні гена нуклеопротеїнів 11-ти вірусів сказуяпонськими вченими було виявлено 9 окремих кластерів по гомології менш
90% регіону N-гена. Тим самим вони підтвердили дані філогенетичноїаналізу, отримані Kissi et al.

Таким чином, варіанти вірусу сказу, згруповані ввідповідно до їх географічним розподілом, можуть бути використанідля дослідження еволюційного розвитку вірусу сказу.

Принципи та методи ЗТ-ПЛР.

Зворотно-транскріптазная ПЛР складається з двох етапів:

1 - синтез комплементарної ДНК з допомогою ферменту зворотної транскріптази і затравки

2 - ампліфікація гена або його фрагментів за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази і коротких олігонуклеотидних 20-30 - члени затравок (праймерів), комплементарних 3'-кінцевим послідовностей антіпаралельних ланцюгів ДНК гена . Повторюючи стадії денатурації, відпалу праймерів і полімеризації (добудова праймерів)

30-35 разів за 2-3 години отримують мільйони копій специфічної ділянки геному вірусів і бактерій.

Аналіз ПЛР-продуктів.

малих аліквотах ПЛР-продуктів розрізають відповідними ферментами іподіляють у 1%-м агарозном гелі. Облік результатів проводять за розміром ПЛР -продуктів за допомогою електрофорезу в агарозном гелі. На підставі розмірів івідстаней пробігів маркерних ДНК обчислюють розміри досліджуваних фрагментів
ДНК.

4. КОМП'ЮТЕРНИЙ Аналіз генетичного ТЕКСТІВ.

Виявлення та аналіз закодованих в послідовності функціональних сигналів вимагає застосування сучасних методів інформатики - якіснихбаз даних з сучасними засобами управління, новітніх методіврозпізнавання образів, статистичних досліджень, застосування спеціальнихалгоритмів для подолання виникаючих обчислювальних труднощів.

В даний час дослідження функціональних властивостей розшифрованихпослідовностей нуклеїнових кислот - це новий розділ молекулярноїбіології, що межує з інформатикою, з одного боку, та молекулярноїбіофізики - з іншого. Можна з упевненістю сказати, що в даний часаналіз послідовності біополімеру дозволяє отримати лише дуженевелику частку закодованою в ній інформації. У кінцевому рахунку точневиявлення функціональних особливостей у послідовності нуклеїновихкислот буде можливо тільки після детального дослідження відповіднихреакцій, здійснюваних нуклеіновобелковимі комплексами.

Для оперативної роботи з послідовностями створюються спеціальнібанки даних. У банку в доступному для користувача вигляді зберігається кожнарозшифрована послідовність та її паспорт, в якому вказані різнівідомості про неї. Це відомості про організм, з якого виділенапослідовність, про документ, де вона описана, про розташування на нійрегуляторних ділянок і білках, які вона кодує і т.д. В данийчас створені три великі бази даних послідовностей нуклеїновихкислот: "Genbank" (Лос-Аламос, США - більше 30 млн. нуклеотидів), базаданих нуклеотидних послідовностей Європейської молекулярно -біологічної лабораторії (EMBL, Гейдельберг, ФРН - понад 30 млн.нуклеотидів) і "Генекспресс" (СРСР, ВИНИТИ-ІМГ АН СРСР - понад 11 млн.нуклеотидів). Відомі також кілька білкових баз даних, найбільшпредставницької з якої є MBRF-PIR (США). Ці бази данихпоширюються на різних носіях - магнітних стрічках і дисках, наоптичних дисках.

Крім побудови філогенетичних древ геномів вірусів комп'ютернийаналіз застосовується при пошуку гомології, розпізнаванні кодують областей,функціональних сигналів, фізичному (рестрикційних) картуванні молекул
ДНК і для передбачення вторинних структур РНК.

Зараз у світі створено велику кількість програм (зазвичайорганізованих у пакети), призначених для аналізу послідовностейнуклеїнових кислот і усувається дослідників від багатьох трудомісткихрутинних операцій, у тому числі: підрахунок числа моно -, ді - ітрінуклеотідов, переклад нуклеотидної послідовності в амінокислотних іт.д.

Усі програми умовно поділяються на два класи: загального призначення іспеціального. Перші здійснюють ряд_ найбільш поширених операційпо збору та аналізу послідовностей і дозволяють: надавати та змінюватинові послідовності, зчитувати з допомогою скануючих пристроївінформацію безпосередньо з автографів або гелів ', знаходити ділянкипізнавання ендонуклеаз рестрикції і представляти результати у зручному
(табличному або графічному) вигляді, знаходити ділянки з елементами поворотноюі дзеркальної симетрії (Паліндроми), транслювати нуклеотиднупослідовність у білкову у всіх трьох рамках зчитування, порівнюватидві послідовності методом точкових матриць гомології, порівнювати новупослідовність з усіма даними Ген Банку, знаходити ділянки,збагачені тими чи іншими нуклеотидами, обчислювати гіпотетичнутемпературу плавлення ДНК, здійснювати автоматичну збіркусеквенувати фрагментів в єдину структуру - молекулу ДНК, транслюватибілкову послідовність у нуклеотидну з урахуванням нерівномірностівикористання кодонів-синонімів, визначати молекулярну масу НК і білків,передбачати вторинну структуру білків, обчислювати вільну енергіюосвіти шпильок і ін

Програми спеціального призначення?? оздаются для вирішення більшспеціальних і часто більш складних завдань і становлять інтерес для більшвузького кола фахівців. Так, наприклад, вони можуть виконувати ряд функцій:обчислення довжини фрагментів ДНК на підставі їх електрофоретичноїрухливості в гелях; вибір гібрідізаціонних зондів; пророкування вторинноїструктури РНК; локалізація нуклеотидів в гені, які можуть бути змінені
(без зміни амінокислотної послідовності) з метою введення сайтупізнавання ендонуклеази рестрикції; знаходження ділянок з потенційноможливою структурою Z-форми ДНК; виявлення функціонально значущих ділянокв невідомій знову розшифрованої структурі на підставі раніше виведеногоконсенсусу (в результаті порівняльного аналізу ряду відомих структур зоднаковою функцією); локалізацію ділянок, що кодують білки, і т.д.

Для прикладу представлено меню пакета програм MICROGENIE, з якихвипливає, які функції загального або спеціального призначення може вибратидослідник при роботі з нуклеотидними послідовностями.

Програма загального призначення "COMMON" забезпечує введенняпослідовності в ЕОМ, а також перевірку введених даних у діалоговомурежимі. Вони дозволяють також редагувати нуклеотидні послідовності:вводити заміни та вставки, виключати нуклеотиди, вирізати, вбудовувати іоб'єднувати нуклеотидні послідовності і таким чином моделюватигібридні і мутантні молекули ДНК. Введення послідовностей в пам'ятьмашини можна здійснювати вручну з клавіатури, але останнім часомстворені прилади для автоматичного сканування авторадіограмм і секвеніру -чих гелів, отриманих внаслідок використання флуоресцентних міток, передачіданих відразу в комп'ютер і подальшого аналізу послідовності здопомогою спеціальних програм. У нещодавно вийшла у видавництві IRL
(Оксфорд) книзі "Аналіз сіквенсів нуклеотидних кислот і білків" детальноописуються як конструкція скануючих пристроїв, так і програми длячитання авторадіограмм. Створені програми для відновлення первиннихструктур високомолекулярних ДНК на базі даних сіквенсів фрагментів,отриманих при її неспецифічному розщепленні (наприклад, ультразвуком,).
Спорідненість між будь-парою фрагментів ДНК виявляється на підставі збігупослідовності нуклеотидів в їх структурах, причому ці збігаютьсяпослідовності і є місцем перекривання і такі два фрагментиможуть бути об'єднані в більш протяжну структуру. Процес відборуфрагментів і стикування триває до. тих пір, поки не буде відновленався первинна структура досліджуваної ДНК. Однією з такого роду програмє "CONTIG" (є її варіант для комп'ютера IBM PC), створенав лабораторії Ф. Сангера (Кембридж, Англія). Нижче наводяться основніоперації, що дозволяє здійснювати програма "CONTIG":

1) зберігання сіквенсів кожного фрагмента;

2) відбір суміжних фрагментів та збирання послідовностей з них;

3 ) порівняння даних, отриманих при читанні нових авторадіограмм, з ужеустано