Функціональна активність лейкоцитів крові щурів, зазнали впливу на них холоду

А. Д. Тяпкина

При дії на організм екстремальних факторів, до числа яких відноситься переохолодження, відбуваються зміни гомеостатичних констант (перш за все що відносяться до системи крові). Білі клітини крові, маючи високу реактивність, швидко включаються в адаптаційні реакції [3]. Вони здатні до неспецифічному реагування у відповідь на альтерірующіе впливу. Переохолодження організму може бути викликано зовнішніми низькими температурами і фармакологічними агентами, здатними знижувати температуру тіла. Це, головним чином, речовини, надають наркотичний ефект. До їхнього числа відноситься етиловий алкоголь, здатний відтворювати всі характерні риси впливу неінгаляційного наркотиків на теплорегуляцію [5].

Зміна функціональної активності лейкоцитів при охолодженні організму, будучи складною медико-біологічної та клінічної проблемою, вивчено недостатньо. Метою нашого дослідження була оцінка деяких функціональних властивостей білих клітин крові при екзогенному охолодженні організму і гіпотермії, викликаної низькою температурою навколишнього середовища в поєднанні з дією етилового спирту.

Матеріал і методи дослідження

Досліди проведені на 30 білих щурах - самцях, поділених на 3 групи: контрольна (I), гіпотермія (II), гіпотермія + алкоголь (III). Тварин II групи охолоджували в воді при температурі 15 ° С до появи ознак "холодового наркозу ". Тваринам III групи за 20 хв. до охолодження вводили через шлунковий зонд 30%-ий розчин етилового спирту (1мл/100г).

Змішану кров для досліджень брали шляхом декапітаціі у попередньо наркотізірованних тварин. Гепаринизированную кров (10ед/мл) центріфугіровалі 10мин. при 1500 об/хв. Збирали лейкоцити, а домішка еритроцитів руйнували 0,83% розчином хлориду амонію. Клітини двічі відмивали ізотонічним буферним розчином. Відмиті клітини ресуспендіровалі і визначали їх концентрацію шляхом підрахунку в камері Горяєва.

Фагоцитоз

Для дослідження поглинаючої спроможності нейтрофілів використовували частки латексу розміром 0,8 мкм. Суміш лейкоцитів з латексом витримували у вологому камері при 37 ° С протягом 30 хв. при поступовому, легкому збовтуванні. Потім готували мазки, фіксували 5 хв. в метанолі і фарбували АЗУР-II-еозином. Поглинальну здатність нейтрофілів оцінювали за кількістю фагоцитуючих клітин (фагоцитарна активність) та середньому числу поглинених часток (фагоцитарний індекс) [6].

Міграційна активність

Для постановки міграції під агарози використовували модифікований варіант, описаний в численних роботах [4,8]. Агарози з додаванням культуральній клітинної середовища 199 нашаровується на предметні скла. Для оцінки спонтанної міграції в агарових гелі за допомогою пробійника вирізали одну лунку, в яку поміщали суспензію лейкоцитів. На другому склі ставили реакцію індукованої міграції. Для цього вирізали групу з двох лунок: одну - для клітинної суспензії, другий - для хемоаттрактанта, в якості якого використовували свіжу плазму крові. Скло поміщали у вологу камеру при 37 ° С на 2 год, потім занурювали в 2%-ий розчин глутарового альдегіду на 60 хв. після фіксації і видалення агарози, клітини фарбували АЗУР-еозином по Романовському. В обох випадках для оцінки локомоціонной активності вимірювали площу розповсюдження клітин і розраховували хемотоксичний диференціал - відношення змін площі індукованої міграції в порівнянні з спонтанною до площі клітинного ареалу при мимовільної міграції (%).

адгезійна здатність

40 мкм суспензії лейкоцитів поміщали в капіляр з внутрішнім діаметром 0,56 мм, попередньо оброблений аутоплазмой. Клітини інкубувати у вологій камері при 37 ° С протягом 60 хв. Потім капіляр перфузіровалі розчином Дульбекко при напрузі зсуву 0,1 Н/м2 і повторно - 30 Н/м2. Вважали число клітин в вихідної суспензії, а також перший (неадгезіровавшіе і з малою силою зчеплення) і другий (з середньою силою зчеплення) змиві. З отриманих даних розраховували число клітин, що залишилися в капілярі (з великою силою зчеплення) [9].

Механічні властивості лейкоцитів

В основу експерименту було покладено методику Tran-Son-Tay R. з співавт. [11]. Витягали капіляри діаметром 4 мкм, поміщали їх у мікрокамеру і з'єднували з манометром. Вся система заповнювалася ізоосмотіческім буфером. Переміщення клітин в капілярі і до капіляри забезпечувалося постійним у всіх дослідах негативним тиском (60 мм вод. ст.). Всі маніпуляції проводили на предметному столику мікроскопа. Для спостережень і вимірів використовували об'єктив 40 ВИ і окуляр-мікрометр МОВ-1-15 *. Реєстрували для кожної клітини первинні параметри (діаметр лейкоцити в початковому стані, довжину і ширину деформованої клітини, час відновлення до сферичної форми).

Осмотична резистентність

Визначення осмотичній стійкості лейкоцитів проводили класичним способом за методом Сторті [10], підраховуючи відсоток клітин, що збереглися після годинної експозиції в 0,2% розчині хлориду натрію.

Результати досліджень та їх обговорення

В як фактор охолодження була обрана вода температури 15 ° С, тому що переохолодження у водному середовищі в порівнянні з повітряною (тієї ж температури) настає в кілька разів швидше [2].

Критерієм опірності білих щурів до максимального охолодження служило час до появи ознак "холодового наркозу" після занурення тварин у воду. Наступ "холодового наркозу" визначалося уповільненням, а потім і порушенням координації плавальних рухів, появою тонічних судом і зануренням на дно акваріума. По ходу дослідження було відзначено наступне.

Для щурів II групи була характерна рухова активність у вигляді плавальних рухів. Час до появи ознак "холодового наркозу" становило в середньому 17 хв. Велика частина тварин III групи була непорушне, але ознаки "холодового наркозу" реєструвалися в середньому через 23 хв. Зміни ректальної температури у тварин II групи склали в середньому 14 ° С, у тварин III групи - 11 ° С. За даними літератури [2], таке зниження температури характеризує середній ступінь гіпотермії.

На основі отриманих в експерименті даних був зроблений аналіз змін активних і пасивних властивостей лейкоцитів в умовах переохолодження організму, в тому числі після введення етилового спирту. Аналіз змін поглинаючої спроможності нейтрофілів в умовах гіпотермії виявив незначне зниження фагоцитарної активності (1%) з одночасним збільшенням числа зайнятих тільки часток (19%). Охолодження в умовах алкогольної інтоксикації негативно позначалося на функціональної активності нейтрофілів: знижувалися обидва показники (ФА-10%, ФИ -17%) (Табл. 1).

Таблиця 1

Показники поглинаючої спроможності нейтрофілів        

Група тварин         

Фагоцитарна активність (%)         

фагоцитарний індекс (отн. од.)             

I група         

92,8 ± 1,01         

9,3 ± 0,3             

II група         

91,5 ± 1,03         

11,1 ± 0,46 *             

III група         

84,1 ± 1,28 *, **         

8,0 ± 0,49 *, **     

Примітка: * - Достовірність відмінностей порівняно з контролем (р <0,05);

** - Достовірність відмінностей в порівнянні з переохолодженням (р <0,05).

Виявлені зміни поглинаючої спроможності відносяться до неспецифічних реакцій захисту фагоцитуючих клітин, тому що частинки латексу, які використовуються нами в дослідах, не є антигенними і можуть поглинатися нейтрофілами за відсутності опсонінов.

Нейтрофіли виконують фагоцитарну функцію як в крові, так і за межами кровоносної русла. Для здійснення даної функції клітини повинні шляхом черезендотеліальной міграції покинути кровотік. Частина з них повільно рухається вздовж судинної стінки і іноді адгезіруется до неї. Інша частина мігрує через ендотелій. Таким чином, адгезія нейтрофілів є необхідною в процесі черезендотеліального транспорту і фагоцитозу.

Проведене дослідження виявило наступні особливості адгезійною здібності лейкоцитів у екстремальних умовах (табл. 2).

Таблиця 2

адгезійна здатність нейтрофілів        

Група тварин         

Неадгезіровавшіе клітини (%)         

Клітини з середнім ступенем   зчеплення (%)         

Клітини з великою силою   зчеплення (%)             

I група         

32,2 ± 4,62         

11,5 ± 2,12         

56,1 ± 6,15             

II група         

50,3 ± 3,89 *         

10,6 ± 0,87         

39,1 ± 4,35 *             

III група         

29,3 ± 3,9 **         

13,1 ± 1,94         

57,6 ± 5,7 **     

Примітка: * - Достовірність відмінностей порівняно з контролем (р <0,05);

** - Достовірність відмінностей в порівнянні з переохолодженням (р <0,05).

При охолодженні тварин адгезійна здатність лейкоцитів достовірно знижувалася (56%), переважно за рахунок клітин з великою силою зчеплення. Поєднання охолодження з введенням алкоголю призводило до повернення числа адгезіровавшіх клітин до рівня контрольних тварин. Стабілізуючий ефект у даному випадку пов'язаний, швидше за все, з гуморальними зрушеннями, опосредуемимі етиловим спиртом. Якщо порівняти динаміку показників III групи тварин з показниками II групи, то можна відзначити різке зниження числа неадгезіровавшіх клітин (42%) і, одночасно, збільшення числа клітин з великою силою зчеплення (33%) і клітин із середньою силою зчеплення (19 %).

Ймовірно, етиловий спирт впливає на біоенергетичні процеси, що торкаються і білі клітини крові.

При оцінці адгезійною здібності повинні враховуватися два роду явищ: 1) міцність фізичного контакту між клітинами і матриксом; 2) распластиваніе лейкоцитів на підкладці, що ускладнює їх видалення з субстрату [7]. Для того, щоб з'ясувати вплив даних процесів на зміну неспецифічної адгезії, необхідно розглянути динаміку міграційної активності.

Таблиця 3

Показники міграційної активності лейкоцитів        

Група тварин         

Площа поширення клітин   при спонтанної міграції (мм2)         

Площа поширення клітин   при індукованої міграції (мм2)         

хемотоксичний диференціал   (%)             

I група         

4,2 ± 0,22         

4,2 ± 0,35         

9,1 ± 6,64             

II група         

4,6 ± 0,18         

4,6 ± 0,26         

4,5 ± 10,19             

III група         

4,7 ± 0,29         

5,6 ± 0,25 *, **         

22,8 ± 7,42     

Примітка: * - Достовірність відмінностей порівняно з контролем (р <0,05);

** - Достовірність відмінностей в порівнянні з переохолодженням (р <0,05).

Аналіз результатів показав, що при охолодженні тварин до ознак "холодового наркозу "міграційні реакції нейтрофілів не відрізнялися від контролю. Поєднання охолодження з дачею алкоголю призводило до підвищення хемокінетіческой активності. У тварин I і II груп хемотаксичні дія не викликало зміни площі міграції. У III групи тварин хемотаксичні дію викликало достовірний приріст площі міграції з 4,7 ± 0,29 мм 2 до 5,6 ± 0,25 мм2. Отже, охолодження організму не впливає на міграційну активність лейкоцитів, а що активізує ефект, викликаний прийомом помірних доз алкоголю до початку охолодження, пов'язаний, швидше за все, з гуморальними зрушеннями, опосредуемимі етиловим спиртом.

При оцінки механічних властивостей лейкоцитів використовували час відновлення деформованої клітини до сферичної форми. Отримані дані говорять про те, що після переохолодження організму час відновлення збільшилася з 2,5 ± 0,44 хв. до 2,8 ± 0,38 хв. (р <0,05). У тварин III групи час "релаксації" було значно нижче в порівнянні з контролем і II групою (2,2 ± 0,29 хв., р <0,01).

Можливо, це відбувається тому, що охолодження негативно впливає на еластичність мембран клітин [1], а етиловий спирт має стабілізуючий ефект за рахунок свого впливу на біоенергетичні процеси в клітині [5].

Осмотична стійкість лейкоцитів при переохолодженні організму знизилася на 13,7% (контроль - 48,8 ± 5,17; переохолодження - 35,1 ± 5,13, р <0,01). При поєднанні охолодження з дачею алкоголю осмотична стійкість підвищилася на 3,4% (52,2 ± 3,82%, р <0,01).

Досліджень по морфофункціональних перебудовам клітин в умовах загальної екзогенної гіпотермії нам не встретілось.По даними [1], локальне охолодження викликає руйнування мембран клітин і деструкцію клітинних органел. Утворюються при це сполуки мають іммуносупрессорнимі властивостями і тому є однією з причин пригнічення імунологічної реактивності організму, спостерігається при локальному дії низьких температур.Проведенное дослідження показало, що при гострій гіпотермії відбуваються неоднозначні зміни фізіологічних реакцій лейкоцитів, які проявляються в зниженні адгезійних властивостей при збільшенні поглинаючої спроможності та стабільності міграційних реакцій нейтрофілів. Поєднання охолодження з дачею алкоголю в більшості випадків викликає підвищення функціональної активності лейкоцитів крові, що, мабуть, пов'язано з його специфічним впливом на обмін речовин.

Список літератури

Авакян А.Р. Імуномодулюючу дію ферментів при локальному охолодженні// Тези доповідей V Російського національного конгресу: Людина і ліки. М., 1998. С. 429 - 429.

Баженов Ю.І. Термогенез і м'язова діяльність при адаптації до холоду. Л.: Наука, 1981. С. 7-11.

Горизонтов П.Д., Білоусова О.І., Федотова М.И. Стрес і система крові. М.: Медицина, 1883. С. 57 - 57.

Дугласс С.Д., Куї П.Г. Дослідження фагоцитозу в клінічній практиці. М.: Медицина, 1983.

Відтворення захворювань у тварин для експериментально-терапевтичних досліджень/Під ред. Н.В. Лазарєва. Л.: Медгиз, 1954. С. 115-117.

Потапова С.Г., Хрустик В.С., Демидова Н.В., Козинець Г.І. Вивчення поглинаючої здатності нейтрофілів крові з використанням інертних частинок латексу// Проблеми гематології та переливання крові. 1977. № 9. С. 58-59.

Редчиц Є.Г., Гузєєва О.В. Адгезія нейтрофілів: патогенетичні та методичні аспекти //Лаб. справа. 1991. № 5. С. 4-8.

Соколова Т.Ф., Редькін Ю.В. Вивчення спонтанної міграційної активності лейкоцитів під агарових покриттям// Лаб. справа. 1983. № 1. С. 31-33.

Mege Y., Eon B., Saux P. et al. Inhibition of Granulocyte Adhesion by Pentoxifylline and Analogues: Effects of Leukocyte function// Proceedings of the Workshop. - France, Saint Paul-de-Vence, 1989. P. 17-23.

Storti E. Pederzini A. Augmentation de la resistance des globules blancs par Padministration de stiblene// Schweiz, Med. Wochenschr. 1955. V 85. P.38-39

Tran-Son-Tay R., Needham D., Yeung A., Hochmuth R.M. Timedependent recovery of passive neutrophils after large deformation// Biophys. J. Biophysical Society.1991. P. 856-866.

Для підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://www.yspu.yar.ru