Введення.
МЕТАБОЛІЗМ - грецьке слово metabole, що означає зміна, перетворення.
У фізіологічному сенсі метаболізм - це проміжний обмін, тобто перетворення певних речовин усередині клітин з моменту їх надходження до утворення кінцевих продуктів (напр., метаболізм білків, метаболізм глюкози, метаболізм лікарських препаратів).
З точки зору промислової біотехнології метаболізм - це утворення в процесі росту і розвитку клітин цінних біохімічних продуктів - деякі з них виділяються в середу (позаклітинні продукти), деякі накопичуються в біомасі (внутрішньоклітинні продукти). За допомогою метаболізму отримують антибіотики, молочну та лимонну кислоту, харчові консерванти і багато інших продуктів.
У природних умовах метаболізм налаштований так, щоб виробляти мінімальна кількість необхідних метаболітів. Промислове виробництво, спрямоване на отримання максимального прибутку, така ситуація ніяк не влаштовує. Тому, для максимізації прибутку необхідно провести оптимізацію наступних технологічних параметрів:
- Виходу продукту в розрахунку на спожитий субстрат;
- Концентрація продукту;
- Швидкість утворення продукту.
Оптимізація технології біосинтезу метаболітів складається з наступних основних етапів [5]:
1) Первісна селекція штаму мікроорганізмів;
2) Визначення оптимальних значень температури, рН, тонічності і потреби в кисні;
3) Визначення оптимального режиму харчування та накопичення біомаси;
4) Зміна генетичної структури організму для збільшення освіти продукту.
Розробка 3-го етапу, безпосередньо пов'язана з біосинтезу. Для знаходження режиму харчування та накопичення біомаси, оптимального для біосинтезу метаболітів необхідно математичний опис процесу [1,2,3,4]. Крім знаходження оптимальних умов проведення процесу, математична модель використовується для автоматизації біосинтезу, що в сучасної біотехнологічної промисловості не менш важливо.
Перш ніж приступити, до опису моделей наведемо прийняті позначення основних кількісних характеристик процесу біосинтезу.
Кінетичні характеристики процесу біосинтезу.
Зазвичай стан процесу визначається наступними основними параметрами:
- Концентрація біомаси мікроорганізмів - Х, г/л;
- Концентрація живильного середовища - субстрату (або його основного компонента) - S, г/л.
- Концентрація продукту - P, г/л.
Кінетичні характеристики процесу відображають швидкість протікання біохімічних перетворень. Ці перетворення, природно, відображаються на всіх зазначених вище параметрах процесу - біомасі, продукт і субстраті.
Важливим показником процесу є швидкість росту біомаси. Для опису швидкості росту використовується така характеристика, як загальна швидкість росту - QX:
(1).
Більший інтерес для характеристики інтенсивності росту представляє не величина QX, а питома швидкість росту в перерахунку на одиницю біомаси (адже зростання біомаси пропорційний концентрації клітин). Вона позначається буквою?:
(2).
Розмірність величини? - [1/ч].
Розглянемо тепер другий параметр процесу ферментації - концентрацію субстрату S. За аналогією зі зростанням біомаси, можна ввести кінетичну характеристику - швидкість споживання субстрату QS:
(3).
Знак '-' означає, що швидкість споживання позитивна, коли концентрація субстрату в середовищі падає (тобто швидкість зміни концентрації негативна).
Аналогічно, питома швидкість споживання субстрату, яку позначимо малою літерою qS, дорівнює:
(4).
При біосинтезі метаболітів, поряд зі зростанням біомаси, відбувається накопичення в середовищі продукту метаболізму (його поточна концентрація - Р).
Загальна швидкість біосинтезу продукту метаболізму QР в періодичному процесі дорівнює:
(5).
Питома швидкість біосинтезу продукту одиницею біомаси позначається qР і дорівнює:
(6).
Для математичного опису біосинтезу продуктів метаболізму різними дослідниками було запропоновано багато різних моделей. Усі ці моделі можна розділити на наступні групи:
1) Математичні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму як функція від питомої швидкості росту;
2) Субстрат-залежні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму;
3) Моделі, засновані на концепції віку культури мікроорганізмів.
Під час біосинтезу відбувається також процес зменшення кількості метаболітів, для опису цього феномена були запропоновані моделі деградації (інактивації) продуктів метаболізму.
Математичні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму як функції від питомої швидкості росту.
Математичний параметр - питома швидкість росту? - Послужив основою складання багатьох математичних моделей біосинтезу продуктів метаболізму. Процеси біосинтезу продуктів здавна ділять на два великих класи - пов'язані з ростом і не пов'язані з ростом. Як приклад першого класу можна назвати біосинтез конститутивних ферментів клітини, а другого класу - біосинтез багатьох антибіотиків, інтенсивний синтез яких відбувається після припинення росту мікроорганізмів.
Питома швидкість біосинтезу пов'язаних із зростанням продуктів може бути виражена простим співвідношенням [5]:
(7),
де YP/X - вихід одиниці продукту з одиниці біомаси: (dP/dX).
Більш складне вираз було запропоновано Людекінгом і Пайрі [6]:
 (8),
де qP0 - емпірична константа.
У цьому випадку біосинтез продукту, з одного боку, асоційований з ростом, а, з іншого, здійснюється спочиваючої клітиною [7]. Модель (8) вперше була запропонована для опису синтезу молочної кислоти.
Є ряд рівнянь, що враховують нелінійний характер зв'язку qP і питомої швидкості росту:
(9),
(10),
де а і в - емпіричні константи.
Рис. 1. Форма залежності qР (?) Для рівнянь (9) та (10).
На рис. 1 показані графіки функцій (9) та (10), ці рівняння дають опуклу (9) та увігнуту (10) криві, що виходять з нуля, але ці функції можуть мати також додатковий вільний член qP0:
(11),
(12).
Тоді графіки функцій (11) та (12) на відміну від (9) та (10) виходять не з нуля, а з деякої точки qP0 на осі y, що продемонстровано на рис. 2.
Рис. 2. Форма залежності qР (?) Для рівнянь (11) та (12).
Можливі також емпіричні рівняння типу [8,9]:
(13), (14).
де а, b, с - емпіричні константи.
Рис. 2. Форма залежності qР (?) Для рівнянь (13) і (14).
За аналогією з рівняннями (11) та (12) рівняння (14) починається, не з 0 по осі ординат, а з деякої точки a, що означає початок синтезу продукту без зростання біомаси.
Субстрат-залежні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму.
З точки зору математики, рівняння, в яких в якості аргументу виступає?, Припускають, що зовсім неважливо, яким чином формується те чи інше значення?. Наприклад, величину? можна змінювати шляхом зменшення концентрації вуглецевого субстрату або азотного субстрату, або шляхом зниження температури або підвищення величини рН. Для процесів, пов'язаних тільки з ростом, можливо швидкість біосинтезу при цьому буде однакова. Для незв'язаних зі зростанням процесів небайдуже, яким шляхом ми будемо змінювати величину?. Лімітування вуглецем, лімітування азотом, підвищення рН або зниження температури, даючи одне і те ж значення швидкості росту, можуть давати зовсім різні швидкості біосинтезу продукту метаболізму. Іншими словами, зв'язок між qP і? не має строго причинно-наслідкового характеру, а обумовлена впливом на обидві ці кінетичні характеристики одних і тих же факторів зовнішнього середовища. Для таких процесів необхідно використовувати рівняння, які в якості аргументів містять незалежно впливають первинні фактори: концентрація того чи іншого субстрату, температура чи величина рН.
Біосинтез продукту може описуватися однофакторний або багатофакторним рівняннями. Крім того, було встановлено, що структури залежностей qP від S, P, температури і величини рН аналогічні структурам таких же рівнянь для зростання біомаси, наприклад: Моно, Андрюса, Перта, Хіншельвуда і т.д. Наприклад, якщо субстрат впливає на qP по Андрюса, то маємо [10]:
(15),
де qm - максимальна питома швидкість біосинтезу продукту;
K'S - константа насичення;
Ki - константа інгібування продуктом.
Багатофакторні залежності тут найчастіше бувають мультиплікативний, ніж адитивними. Наведемо залежність мультиплікативного [11] і аддитивного впливу концентрації субстрату за механізмом Моно:
(16),
(17).
Застосовуються також рівняння з не розділяються ефектами чинників, наприклад, типу Контуа [10] або неконкурентного гальмування продуктом [5]:
(18),
(19).
На жаль, неможливо викласти всі кінетичні залежності біосинтезу продуктів від первинних чинників в настільки короткій роботі. Даний матеріал докладно викладено в монографії [14], в якій наведено не лише кілька десятків рівнянь, але і проведений їх аналіз.





Моделі, засновані на концепції віку культури мікроорганізмів.
Для біосинтезу продуктів метаболізму часто буває недостатньо тільки сприятливих "зовнішніх" факторів середовища. Тому що в біосинтезі беруть участь внутрішньоклітинні ферменти мікроорганізмів, проміжні продукти, вміст яких у клітині залежить від передісторії розвитку культури. Занадто швидко виросла культура часто неефективна з точки зору біосинтезу продукту. У мікробіологів є вираз "культура пішла в бадилля", що означає біомаси - багато, продукту - мало або взагалі немає. Однак, враховувати ці внутрішньоклітинні компоненти при моделюванні дуже проблемно - їх важко вимірювати і відповідно знаходити кінетичні коефіцієнти.
Замість цього запропоновані деякі феноменологічні підходи до оцінки фізіологічного стану мікробної біомаси, засновані на оцінці вікового стану популяції клітин.
Є кілька підходів для обліку віку культури. Один з них полягає у визначенні розподілу клітин мікроорганізмів по віку [12]. Тоді значення питомої швидкості біосинтезу продукту можна вважати як би сумою швидкостей, що даються різними віковими фракціями біомаси:
(20),
де? Xi - концентрація біомаси i-ої вікової групи;
qi - питома швидкість біосинтезу біомасою i-ої вікової групи.
При цьому, цілком можливо, що значення q1, q2, ... , qn не будуть однаковими: "молодь" не синтезує потрібний продукт, занадто старі клітини - теж.
Японським вченим Аібой був запропонований більш простий підхід, використовувати для оцінки віку культури так званий середній вік популяції як параметр, що визначає Біосинтетичними активність культури [13]. Біологічно термін цілком зрозумілий - це сума віку всіх клітин, поділена на їх кількість:
(21),
де? i - вік i-ої вікової групи.
Якщо послідовно зменшувати Піддіапазони? T і??, Довівши їх до нескінченно малих dX і dt, то для середнього віку можна отримати інтегральну формулу:
(22),
де Х0 - початкова концентрація біомаси;
- Середній вік культури в початковий момент культивування.
Іншим способом спрощення вікової залежності є поділ вікового діапазону клітин на 2 класу - продуктивний (вище деякого значення) і не продуктивний [14]:
(24),
де? * - вік зрілості;
qP * - питома швидкість біосинтезу клітини, після досягнення нею віку зрілості.
Тепер залишається розглянути форму залежності питомої швидкості біосинтезу продукту qР від середнього віку культури:.
Якщо залежність має зростаючий характер з насиченням, то залежність зручно виразити у формі, схожій на рівняння Моно:
(25).
Якщо, навпаки, вона падає з віком, то краще підходить вислів, подібне рівняння Єрусалимського:
(26).
Якщо залежність має екстремум, то воно може бути виражена, наприклад, за допомогою апроксимує поліноміальною рівняння [15]:
(27).
Однозначна залежність між qР і на практиці зустрічається рідко, часто залежність швидкості біосинтезу продукту від віку враховують у вигляді мультиплікативного співмножники, сполученого з основною частиною рівняння, що враховує впливу інших факторів.

Моделі деградації (інактивації) продуктів метаболізму.
Не завжди синтезовані продукти метаболізму залишаються стійкими; часто вони настільки нестабільні, що руйнуються вже в процесі самої ферментації. Тому, описуючи матеріал баланс по продукту метаболізму, необхідно враховувати кінетику його інактивації:
(28),
де - швидкість деградації продукту метаболізму.
При розгляді синтезу метаболітів, використовувалася питома швидкість, у разі деградації, вводити питому швидкість не коректно, тому що продукт існує окремо від біомаси, і його деградація не залежить в загальному випадку від її концентрації.
Розглянемо моделі кінетики деградації:
(29),
деградація відсутня.
(30),
деградація йде з постійною швидкістю. Таке вираження дивно виглядає на початку процесу, коли продукту ще немає; з рівняння ж виходить, що концентрація продукту знижується нижче нуля, що не має фізичного сенсу.
(31),
реакція розкладу першого порядку, пропорційно кількості утвореного продукту [16].
(32),
реакція розкладу n-ого порядку, при чому n може бути як більше 1, так і менше і не бути цілим числом.
(33),
реакція розкладу залежить не тільки від концентрації продукту, але й від концентрації біомаси.
(34),
швидкість реакції розкладу залежить від концентрації біомаси і зростає з концентрацією продукту до якоїсь межі.
Наведені рівняння інактивації (29) - (34) найбільш поширені, існують також і інші більш складні залежності.
Модель накопичення продукту метаболізму на прикладі лейцину.
L-лейцин-незамінна амінокислота, необхідна для промислового отримання лізину. Виробництво лізину базується на лейцінозавісімих штамах. Річне виробництво лізину складає приблизно 500000 т/м. Лізин широко використовується в с/х в якості кормової добавки. Лейцин також застосовується в спортивному харчуванні, тому що є попередником незамінних жирних кислот, що входять до складу клітинних мембран.
Елементна формула L-лейцину (L-?-Аміноізокапроновая кислота): C5H10NH2COOH.
Основним способом виробництва L-лейцину є мікробіологічний синтез з використанням штаму Corynebacterium glutamicum. Біосинтез проводився у лабораторному біореактори. У відбираються пробах визначалася оптична щільність - Х, зміст лейцину - P і зміст редукуючих речовин (РВ) з Бертрану - S.
Отримані результати наводяться в таблиці 1.
Таблиця 1.

Найпростішим припущенням про механізм мікробіологічного Біосинтетичними процесу є узагальнення даних про те, що біосинтез, з одного боку, асоційований з зростанням, а з іншого, здійснюється спочиваючої клітиною.
Тому було вирішено використовувати наступне співвідношення (8):
(35),
де P - концентрація продукту (лейцину), г/л;
aP, bP - емпіричні константи.
aP, bP були визначені методом найменших квадратів: aP = 13.27, bP = 1.249, сума квадратів відхилень QP склала 0,884, а середня квадратична помилка SP дорівнює ± 0.6648.
На рис. 3 показані експериментальні значення концентрації лейцину і модельні, з малюнка видно, що модель (8) в даному випадку досить добре описує біосинтез продуктів метаболізму.
Рис. 2. Графічна інтерпретація моделі біосинтезу лейцину (35).



Список літератури.
1. Арзамасцев А.А., Андрєєв А.А Математичні моделі кінетики мікробного синтезу: можливості використання і нові підходи до розробки// Вестн. Тамба. ун-та. Серія: Єства. і техн. науки .- 2000 .- т.V., № 1 - с. 111-130.
2. Renss M. Моделювання та оптимізація процесів// 8th Int. Biotechnol. Symp., Paris-1988 .- vol. 1 .- p. 523-536.
3. Zeng An-Ping Кінетична модель одержання продуктів мікробних клітин та клітин ссавців// Biotechnol. and Bioeng .- 1994 .- vol. 45., N 4 .- p. 314-324.
4. Vanrolleghem P.A. Структурний підхід для вибору серед кандидатів у модель схеми метаболізму та встановлення невідомих стехіометричних коефіцієнтів// Biotechnol. and Bioeng .- 1998 .- vol. 2., N 3 .- p. 133-138.
5. Перт С.Дж. Основи культивування мікроорганізмів і клітин .- М.: Мир .- 1978.
6. Luedeking R., Piret E.L. A kinetic study of the lactic acid fermentation: Batch process at controlled pH// J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng .- 1959 .- vol. 1., N 4 .- p. 393-412.
7. Осипов Д.С., Гусельникова Т.В. та ін Математична модель біосинтезу L-лейцину// Праці МГУІЕ .- 2001 .- т.V. - с. 19-23.
8. Mori A., Terui G. Kinetic studies on submerged acetic acid fermentation: Inhibition by ethanol// J. Ferment. Technol .- 1972 .- vol. 50, N 11 .- p. 776-786.
9. Музиченко Л.А., Валуєв В.І. Використання полунепреривного культивування мікроорганізмів для одержання продуктів біосинтезу// В кн.: Теорія і практика безперервного культивування мікроорганізмів .- Красноярськ .- 1978 .- с. 112-113.
10. Bajpai R.K., Reuss M. A mechanistic model for penicillin production// J. Chem. Technol. and Biotechnol .- 1980 .- vol. 30, - p. 332-344.
11. Баснакьян І.А., Бірюков В.В., Крилов Ю.М. Математичний опис основних кінетичних закономірностей процесу культивування мікроорганізмів// В кн.: Підсумки науки і техніки. Мікробіологія. Т. 5. Кероване і безперервне культивування мікроорганізмів .- М. - 1976 .- с. 5-75.
12. Shu P. Mathematical model for product accumulation in microbiological processes// J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng .- 1961 .- vol. 3, N 1, - p. 95-109.
13. Aiba S., Hara M. Conception of average cumulative age of microorganisms// J. Gen. and Appl. Microbiol .- 1965 .- vol. 11, - p. 25-41.
14. Бірюков В.В., Кантер В.М. Оптимізація періодичних процесів мікробіологічного синтезу .- М.: Наука .- 1985.
15. Фишман В.М. Математичний опис і оптимальне керування процесом біосинтезу антибіотиків// Дис. канд. техн. наук .- М.: Московський інститут хімічного машинобудування-1970.
16. Ettler P., Votruba J. Determination of the optimal feeding regime during biosynthesis of erythromycin// Folia microbiol .- 1980 .- vol. 25, - p. 424-429.