ВСТУП
Молекула АТФ давно відома як повсюдно розповсюджене джерело енергії для внутрішньоклітинного метаболізму. Але її властивості як нейротрансмітера були виявлені порівняно недавно. Сьогодні вже не залишилося жодних сумнівів, що АТФ є нейротрансмітером в автономних нейром'язовий з'єднаннях, гангліях і центральній нервовій системі. Наприклад, було показано, що АТФ залучена в генерацію больових сигналів через Р2Х1 і Р2Х2 рецептори. Однак роль і розподіл пурінорецепторов в корі головного мозку і особливо в моторному корі до цих пір залишається слабо вивченою. Тому вивчення механізмів дії АТФ в корі головного мозку представляє безперечний інтерес. Ми вивчали дію АТФ за допомогою виміру концентрації внутрішньоклітинного кальцію, - одного з найбільш важливих і універсальних регуляторів клітинних функцій.
Мета роботи полягала у вивченні механізмів генерації АТФ - індукованих внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів у нервових клітинах моторної кори.


2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
2.1 Гомеостаз кальцію в нервових клітинах
Концентрація цитозольного кальцію в клітині регулюється трансмембранним транспортом і цитоплазматичних зв'язуванням кальцію. Рух іонів кальцію через мембрану контролюється: 1) двома родинами Са2 + каналів, як то: кальцієвими каналами плазмалемми і кальцієвими каналами, розташованими в мембрані ендо (Сарко) плазматичного ретикулуму (ЕР або СР), які формують шляхи входу кальцію в цитоплазму; 2) висновком кальцію з цитоплазми завдяки активності кальцієвих насосів плазмалемми та/або кальцієвих обмінників; і 3) акумуляцією іонів кальцію внутрішньоклітинними кальцієвими депо і мітохондріями. Останні служать системами кальцієвого буфера, здатними акумулювати та накопичувати іони кальцію, підтримуючи таким чином гомеостаз кальцію в цитоплазмі.
2.1.1 кальцієві канали плазматичної мембрани
Нервові клітини експресують різні типи кальцієвих каналів плазмалемми, які можуть бути активовані різними впливами. Грунтуючись на механізми активації, кальцієві канали можуть бути розділені на кілька типів потенціал - керованих і рецептор - керованих каналів.
Потенціал - керовані канали роблять суттєвий внесок як в регулювання входу кальцію в цитоплазму, так і в нейрональний електрогенез. Білки, що утворять кальцієві канали, складаються з 5 субоедениц (1, 2,,,). Головна субоедениц 1 формує власне канал і містить місця зв'язування для різних модуляторів кальцієвих каналів. Було виявлено кілька структурно різних 1 субоедениц кальцієвих каналів в нервових клітинах ссавців (позначених як A, B, C, D і E). Функціонально кальцієві канали різних типів відрізняються один від одного активацією, кінетикою, провідністю одиночного каналу і фармакологією. У нервових клітинах описано до 6 типів потенціал - керованих кальцієвих каналів (T-, L-, N-, P-, Q-, R-канали). Активність потенціал - керованих каналів плазмалемми регулюється різними внутрішньоклітинними вторинними посередниками і мембранозв'язаних G-білками (33,26).
Другий важливий шлях потоку іонів кальцію через мембрану пов'язаний з активацією агоніст - керованих каналів. Багато агоніст - керовані канали мають значну кальцієвої проникністю за фізіологічних умов. Таку кальцієву проникність виявляють нейрональні ацетилхолін (Ach)-керовані, глутамат-керовані (NMDA і AMPA/Каінат типи) і пурінорецептори (10,18,49,34). Крім кальцієвих каналів плазмалемми, керованих зовнішніми впливами, в клітині було відкрито також кілька типів кальцієвих каналів, контрольованих внутрішньоклітинними вторинними посередниками. Зокрема, IP3-керовані кальцієві канали були виявлені в нейронах Пуркіньє мозочка (34), а IP4-керовані кальцієві канали - в клітинах ендотелію (35).
Третій, недавно виявлений, особливий тип Са2 + каналів, який контролює заповнення внутрішньоклітинних кальцієвих депо, здійснюючи таким чином прямий зв'язок між звільненням Са2 + в цитоплазму з депо і вхід у неї Са2 + через плазмалемму.
2.1.2 кальцієві буфери
Більша частина іонів Са2 +, що входять в клітину, практично негайно зв'язується цитоплазматичними місцями зв'язування кальцію. Показано, що лише менше 1% іонів кальцію, які проникають в цитозолі, залишається в незв'язаному стані (11). Цитозольних кальцієві буфери представлені головним чином Са2 +-зв'язуючими білками, такими як парвальбумін, кальмодулін, тропоніна-С, кальретінін, кальціунеурін, білок S-100 (25). Крім того, цитозольних буферна ємність може бути опосередкована АТФ, яка здатна зв'язувати значну кількість Са2 + (64). 20-50% цитозольних кальцієвих буферів можуть бути вилучені з цитоплазми при перфузірованіі клітини, що показує їх мобільність, у той час як решта Са2 +-зв'язує ємності відноситься до фіксованих буфера. Мобільні кальцієві буфери можуть відігравати важливу функціональну роль, сприяючи дифузії іонів Са2 + в цитоплазмі та розповсюдження Са2 + сигналу по клітці. Внутрішньоклітинний введення ендогенних Са2 + буферів (кальбіндіна D28k і парвальбуміна) через мікропіпетку призводило до збільшення швидкості наростання [Ca2 +] i на кілька порядків і суттєво впливало на кінетику зміни [Ca2 +] i, що підтверджує роль мобільних Са2 + буферів з низькою молекулярною вагою в ефективному регулюванні внутрішньоклітинної концентрації кальцію.
2.1.3 кальцієві канали ЕПР
Са2 + канали ЕР є олігометріческімі протеїнами, вбудованими в мембрану ЕР. Ці канали можна відносно легко виділити з клітини для подальшого структурного аналізу завдяки тому, що білки каналу зв'язуються специфічно і з високою спорідненістю з IP3 (для IP3-керованих каналів) і з ріанодіном (для Са2 +-керованих каналів).
Са2 +-керовані Са2 + канали ЕР. Ці кальцієві канали були вперше виділені з скелетних та серцевих м'язів. Виявилося, що Са2 + канали ЕР в цих м'язових тканинах мають молекулярні відмінності і закодовані різними генами. Са2 + канали ЕР в серцевих м'язах безпосередньо пов'язані з високопороговимі Са2 + каналами плазмалемми (L-тип) через кальційзв'язуючий білки, створюючи, таким чином, функціонально активну структуру - «тріаду». У скелетних м'язах деполяризація плазмалемми прямо активує звільнення Са2 + з саркоплазматичного ретикулуму завдяки тому, що Са2 + канали плазмалемми служать потенціал - чутливими передавачами активуючого сигналу безпосередньо Са2 + каналів ЕР через що зв'язують білки (44). Таким чином, Са2 + депо скелетних м'язів володіють механізмом звільнення Са2 +, що викликається деполяризації (RyR1-тип). На відміну від скелетних м'язів, саркоплазматичний Са2 + канали кардіоміоцитів не пов'язані з плазмалеммой, і для стимуляції звільнення Са2 + з депо потрібне збільшення концентрації цитозольного кальцію (RyR2-тип). ДНК, що кодує білки двох типів каналів Са2 + звільнення, була клонована з тканин людини та кролика, що дало можливість експресувати Са2 +-керовані Са2 + канали в модельні клітинні системи. Білки, вбудовані в ліпідний бішар, формують чутливі до ріанодіну канали, що активуються іонами Са2 + (50 нмоль/л) в присутності АТФ (29). Крім цих двох типів Са2 +-активуються Са2 + каналів, нещодавно був ідентифікований третій тип Са2 + каналів ЕР (RyR3-тип), який є продуктом іншого гена. Цей третій тип Са2 + каналів ЕР, як було показано, не чутливий до кофеїну (21). Експерименти, проведені на нервових тканинах, продемонстрували присутність всіх трьох типів Са2 +-керованих Са2 + каналів ЕР в мозку ссавців, проте RyR2-тип є домінантним (38). Са2 +-керовані Са2 + канали ЕР є гомотетрамерамі, що складаються з мономерів з молекулярною вагою 500 КД (39)
IP3-керовані Са2 + канали ЕР. Існування IP3-керованих Са2 + каналів вперше було виявлено в нейронах Пуркіньє. Пізніше було показано, що вони вбудовані в мембрану ЕПР. Структура IP3-керованих Са2 + каналів схожа із структурою Са2 +-керованих Са2 + каналів ЕР. Вони також є гомотетрамерамі з молекулярною вагою мономеру 260 КД. 50% цих каналів активується 15 мкмоль/л IP3 і блокується рутенієм червоним і La3 +. IP3-керовані Са2 + канали були виділені з мозку ссавців, і їх амінокислотна послідовність була розшифрована. Було показано, що сімейство генів, експресуються IP3-керовані Са2 + канали, складається з трьох або чотирьох різних генів; вони характеризуються різною чутливістю до IP3 і по-різному розподілені в мозку ссавців (45). Поріг активації цих каналів варіює між 0.2 - 0.5 мкмоль/л у нейронах Пуркіньє мозочка і зростає до 9 мкмоль/л в астроцитів.
2.1.4 кальцієві насоси
Існує два сімейства Са2 + насосів, відповідальних за усунення іонів Са2 + з цитоплазми: Са2 + насоси плазмалемми і Са2 + насоси ЕПР. Хоча вони відносяться до одного сімейства білків (так званому P-класу АТФ-аз), ці насоси виявляють деякі відмінності в будові, функціональної активності та фармакології.
Кальцієвий насос плазмалемми. Са2 + насос плазмалемми, який видаляє іони Са2 + з цитоплазми в міжклітинний простір, був відкритий в 1966 році. Молекулярні властивості Са2 + насосів плазмалемми описані в кількох оглядах (18), однак достовірних даних про швидкість виведення Са2 + і регуляції Са2 + насосів в нервових клітинах небагато. Нещодавно був розроблений двухфлуоресцентний мікрокрапельні метод (58), що дозволяє одночасно вимірювати [Ca2 +] i і вихід Са2 + назовні на одиночних клітинах. Дослідження, проведені за допомогою даного методу на нейронах молюска і секреторних клітинах, показали, що активність Са2 + насоса плазмалемми контролюється безпосередньо [Ca2 +] i: збільшення концентрації цитоплазматичного кальцію активує Са2 + насос (58). У нейронах молюска близько 40% іонів кальцію, що входять в клітину у відповідь на деполяризацію мембрани, виводиться з нейрона вже під час фази наростання [Ca2 +] i, відображаючи таким чином активацію кальцієвого насоса плазмалемми збільшенням концентрації цитозольного Са2 + (58).
Кальцієвий насос ЕПР. У багатьох клітині, поряд з Са2 + насосом плазмалемми, існує кальцієвий насос Сарко (ендо) плазматичного ретикулуму (SERCA). В даний час описано принаймні 3 різних ізоформи SERCA-насосів в клітинах ссавців. SERCA1-підтип зосереджений виключно в швидких скелетних м'язах, SERCA2-насоси широко поширені в інших тканинах. Значимість SERCA3-насосів менш чітка (13). Білки-SERCA2 насосів поділяються на дві різні ізоформи: SERCA2а, характерні для кардіоміоцитів і гладеньких м'язів, і SERCA2b, характерні для тканин мозку. Передбачається, що насоси SERCA різними способами регулюються цитоплазматичної і інтралюмінальной концентраціями Са2 +: Збільшення [Ca2 +] i активує захоплення іонів кальцію в ЕР, в той час як збільшення вільного кальцію усередині ЕР інгібує насоси SERCA (12). Насоси SERCA ефективно та селективно блокуються тапсігаргіном в наномолярних концентраціях (37) і мікромолярнимі концентраціями ціклопіазоновой кислоти. Однак, тапсігаргін викликає також блокаду потенціал - керованих кальцієвих каналів плазмалемми, як це показано на клітинах коркового шару наднирників і на сенсорних нейронах (Shmigol et al., 1995), тому його варто використовувати з певною обережністю.
2.1.5 кальцієві обмінники
Додатковим механізмом, відповідальним за виведення іонів кальцію з цитоплазми, є натрій-кальцієвий обмінник, який виводить Са2 +, використовуючи енергію натрієвого електрохімічного градієнта. Наявність Na + - Са 2 + обмінника було показано в різних типах збудливих і невозбудімих клітин; в клітинах нервової системи він був виявлений в кінці 60-х років (9). У нейронах молюска, вміщених у середу зі зниженим натрієм (тобто із зворотним натрієвих градієнтом), спостерігалося збільшення [Ca2 +] i, що є результатом роботи обмінника в інвертованою формі. Однак, вклад Na + - Са 2 + обмінника в регулювання [Ca2 +] i в нейронах ссавців до цих пір не оцінений. У деяких роботах було показано, що обмінник приймає незначну участь у видаленні цитоплазматичного Са2 +, в той час як в інших роботах представлені дані про те, що обменник відіграє істотну роль у перенесенні Са2 + через мембрану (57).
2.1.6 Са2 +-зв'язують органели
Крім швидкого зв'язування цитозольного Са2 + внутрішньоклітинними Са2 +-зв'язуючими білками, іони кальцію, що потрапляють в цитозолі, можуть акумулюватися апаратом Гольджі або клітинним ядром, захоплюватися мітохондріальними Са2 + депо, що мають досить невисоку спорідненість до Са2 +, або швидкими депо, пов'язаними з ЕР або СР, що мають високу спорідненість до Са2 +. Однак якщо [Ca2 +] i перевищує 0,5 мкмоль/л, спостерігається суттєвий перерозподіл [Ca2 +] i в область мітохондрій. Буферні системи мітохондрій беруть участь у видаленні надлишкового Са 2 + з цитоплазми в клітинах кишечнику, деяких типах нервових клітин (59) і в секреторних клітинах після підвищення [Ca2 +] i, стимульованого агоністами. Зв'язування кальцію мітохондріями забезпечується активністю систем, розташованих на внутрішній мітохондріальної мембрані. Са2 + надходить в мітохондрії з електрохімічного градієнту; різниця потенціалів, що забезпечує транспорт кальцію, створюється перенесенням електронів під час клітинного дихання і пов'язаного з ним перенесенням протонів. Перенесення електронів по дихального ланцюга є основним механізмом, що забезпечує енергетику транспорту кальцію. Придушення дихального ланцюга карбоніл-ціанід-м-хлорофеніл-гідразоном (СРСР) ефективно блокує акумуляцію кальцію мітохондріями (41).
2.2 Вплив АТФ на кальцієвий гомеостаз
Останні дослідження показали, що АТФ займає міцне місце в ряді нейромедіаторів центральної та периферичної нервової систем (Burnstock 1990). Не викликає сумніву, що АТФ є не тільки найважливішим внутрішньоклітинним метаболітом, але і є важливим об'єктом міжклітинної взаємодії.
2.2.1 Будова і властивості АТФ


АТФ (див. рис.1) являє собою нуклеотид і як всякий нуклеотид складається з трьох компонентів: азотистої основи, цукру пентози і фосфату. Як азотистого заснування в нуклеотидах присутні похідні пурину і піримідину. Фосфати з'єднані в поліфосфатную ланцюг, кількість яких у природних нуклеотидах не перевищує трьох. Однак синтезовані нуклеотиди, що містять лінійні ланцюги з більш ніж 3-х фосфатів, приміром аденозінтетра-і аденозінпентафосфати.
Назви нуклеотидів, що містять в якості цукру рибозу, складаються з назви відповідного нуклеозиду, приставки, що позначає кількість фосфатних груп у нуклеотидів та слова фосфат. Для найбільш поширених нуклеотидів прийняті скорочені назви, наприклад АТФ для аденозинтрифосфату, ГТФ - для гуанозінтріфосфата, ІМФ - інозінмонофосфата.
В області нейтральних значень pH нуклеїнові підстави і рибоза в розчині не заряджені (Мартін, Маріам, 1982). Нуклеотиди, через наявність фосфатів, являють собою сильні кислоти. АТФ містить чотири ОН групи, здатні до іонізації, три з яких мають pKa нижче 3, а pKa четвертій - 6,5 (Ленінджер, 1976). Таким чином, при pH 7,4 переважна більшість молекул АТФ представляють собою четирехзарядние аніони АТФ4-, крім того, в розчині присутня невелика кількість АТФ3-.

2.2.2 Номенклатура і субклассіфікація пурінорецепторов.
Перше розділення пурінорецепторов на Р1 і Р2 типи грунтувалося на наступному критерії: нуклеозиди такі як аденозин активували Р1 пурінорецептори, у той час як АТФ стимулювала Р2 пурінорецептори, а метилксантини (кофеїн, теофілін) є селективними антагоністами Р1 пурінорецепторов. Також Р1 пурінорецептори пов'язані з аденілатциклази, а активація Р2 пурінорецепторов може приводити до вироблення простогландінов (Burnstock 1978).
2.2.3 Р1 пурінорецептори.
У 1979 році (Van Calker et al 1979) показали, що аденозинові,? 1 - пурінорецептори можна підрозділити на дві групи. Рецептори однієї з них мали дуже високою спорідненістю до аденозину (константа дисоціації Кd = 3 - 10 нМ). При взаємодії аденозину з цією групою рецепторів спостерігалося пригнічення аденілатциклази і, отже, зменшувався рівень внутрішньоклітинного цАМФ. Цей клас рецепторів був названий А1-рецепторами (Ri рецептори по (Londos et al 1980)). Аденозинові рецептори, що відносяться до другої групи, мали більш низьку спорідненість з аденозину (Кd комплексу аденозину з рецептором 5-10 мкм). Активація цього типу рецепторів приводила до стимуляції аценілатціклази. Ці рецептори Ван Колкер назвав А2-рецепторами (Ra рецептори по (Londos et al 1980)). Були виявлені також і потужні антагоністи для А1 - R-N6-Фенілізопропіладенозін (R-PIA). Для А2 сильнішим антагоністом був 5'-N-етілкарбоксамідаденозін (NЕСА). Також існують роботи, в яких описуються аденозинові рецептори, не пов'язані з аденілатциклази ці пурінорецептори було запропоновано назвати А3 (Ribeiro and Sebastiao 1986). Передумовою до поділу А2 пурінорецепторов на А2А і А2b підтипи стало відкриття різного спорідненості NECA до Р1 пурінорецептору, - високого в стріатуме (А2А) і низького в фібробластах (А2b) (Bruns et al 1986).
2.2.4 Р2 пурінорецептори
Накопичені фармакологічні докази, як-то: тип відповіді, порядок активності агоністів, десенсітізація, що викликається АТФ та її структурними аналогами, послужили основою для першого субделенія Р2 пурінорецепторов. У 1985 році Бернсток і Кеннеді (10) вказали на неоднорідність популяції Р2-пурінорецепторов. Цей висновок був зроблений виходячи з того, що в деяких тканинах (наприклад поздовжня м'яз сліпої кишки) АТФ викликав розслаблення гладких м'язів, а в інших (м'язова стінка сечового міхура) - скорочення. Перший підтип рецепторів був позначений як Р2у, а другий - Р2х. Для Р2х пурінорецепторов найбільш активним агоністом був?,? - Метилен АТФ (?,?- Матв), а для Р2у - 2 - метілтіо АТФ (2-МеSАТP). Так як порядок активності лігандів може залежати від швидкості їх гідролізу до неактивних з'єднань, яка може значно відрізнятися в залежності від тканини, більш чітким доказом для підрозділу Р2 - рецепторів на підтипи служить наявність селективних блокаторів. Зараз відомі селективні антагоністи як для Р2х, так і Р2у-рецепторів для Р2х -?,?-Матфей (десенсітізірующее дія), арілазідамінопропіоніл АТФ (АНАПП3), пірідоксалфосфат-6-азофеніл-2 ', 4'-Дисульфідний кислота (PPADS), сурамін та інші; для Р2у пурінорецепторов - реактив синій 2, сурамін. У 1986 році Гордон (23) запропонував виділити з класу Р2 пурінорецепторов ще два підтипи Р2t і Р2z. Перший рецептор розташовується у тромбоцитах і управляє їх агрегацією. Він, на відміну від усіх інших підтипів P2 - рецепторів, активується АДФ, і блокується АТФ. Р2z рецептори розташовані в тучних клітинах. У них АТФ у дуже великих концентраціях (> 100 мкм), а точніше четирехзарядний аніон АТФ4-, викликав кальційзавісімую секрецію гістаміну. Інші пуринові нуклеотиди, включаючи негідролізуемие аналоги АТФ, не активували рецептор. Також був виявлений Неселективний антагоніст даного типу рецепторів DIDS - аналог PPADS (Soltoff et al 1993). У 1991 році O'Connor запропонував так званий нуклеотидних рецептор однаково чутливий як до АТФ, так і до УТФ, але не чутливий до 2 - MeSATP. Цей рецептор отримав позначення Р2u. Можливим антагоністом даного рецептора є сурамін. Також було виявлено, що аденін динуклеотид поліфосфати також присутні в фармакологічної периферії (Hoyle 1990). Hildermann (1991) індентіфіціровал сайт зв'язування для діаденозін тетрафосфат (Ap4A) в мозку щура, який отримав назву діпурінергіческого рецептора, а пізніше Р2d (Pintor et al 1993). Антагоністи даного виду пурінорецепторов поки не виявлені.
ПУРІНОРЕЦЕПТОРИ


Р1 - пурінорецептори

Р2 - пурінорецептори





























A1

A2a
A2b

A3

P2x

P2y

P2t

P2z

P2u

P2d
Таблиця 1. Класична схема субклассіфікаціі пуринів-рецепторів.
2.2.5 Рекласифікація пурінорецепторов.
Из - за всезростаючих труднощів та неузгодженостей в класичній схемі класифікації? 2 пурінорецепторов і збільшується числі підтипів рецепторів, стало очевидним, що класична схема вимагає перегляду. У 1994 році Abbracchio and Burnstock запропонували нову схему класифікації Р2 - пурінорецепторов. З усіх Р2 - пурінорецепторов вони виокремили три основні сімейства: Р2Х сімейство, пов'язане з іонотропнимі каналами, що включало чотири підтипи; Р2У - пов'язана з активацією G - білків, що включає сім підтипів і сімейство Р2Z - родина неселективних пір. Їх гіпотеза грунтувалася в основному на вивченні літературних джерел та аналізі фармакологічного профілю новообнаруженниж агоністів. Надалі теорія підтвердилася клонуванням різних підтипів Р2 - пурінорецепторов. В даний час сімейство Р2Х нараховує шість, а Р2У - сім підкласів. Завдяки інтенсивним дослідженням, практично не залишається сумнівів в тому, що дані сімейства будуть рости і далі (Collo et al 1996).

Р2 - ПУРІНОРЕЦЕПТОРИ




P2Z - неселективні пори




Р2Х - родина
іонотропних
рецепторів

Р2У - родина
метаботропних
рецепторів























Р2Х1
Р2Х2
Р2Х3
Р2Х4
Р2Х5
Р2Х6
Р2У1
Р2У2
Р2У3
Р2У4
Р2У5
Р2У6
Р2У7
Таблиця 2. Сучасна класифікація Р2 типу пурінорецепторов.

3. ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
3.1 Підготовка препарату
Дослідження проводилися на пірамідальних нейронах моторної області нової кори в тонких зрізах мозку, виділеного з 14 денних щурів. Після декапітаціі мозок містився в холодний сольовий розчин (0 - 40С). Процедура від початку декапітаціі до виділення мозку тривала не більше 60-90 секунд. Потім мозок закріплювався поліакриламідних клеєм на підкладці вібротома (Campden, Campden Instruments LTD, UK); камера вібротома заливалася холодним сольовим розчином. Зрізи нарізалися сагітальному товщиною 250 - 300 мкм; швидкість подачі леза - 1 см/с з частотою 10 Гц. Після приготування зрізи містилися в розчин постійно насичуємо карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи інкубувати в постійно оксігеніруемом розчині 30 хвилин при температурі 32 градуси. Забарвлення зрізу здійснювалася протягом 30 - 35 хвилин в СО2 насиченому термостаті при температурі 35 градусів. Після фарбування зрізи відмивалися 1 - 1,5 години на постійно оксігеніруемом розчині при кімнатній температурі. Всі експерименти проводилися при температурі 32 градуси.
3.2 Характеристика кальцієвого зонда

Для кількісного визначення концентрації кальцію в пірамідальних нейронах моторної області нової кори використовувався барвник Фура-2 AM (малюнок 2) (16).

На малюнку 3 представлений спектр зонда Фура -2 AM. При зв'язуванні з кальцієм відбувається характерна зміна спектру порушення цієї барвника: при збудженні світлом з довжиною хвилі 390 нм відбувається зменшення флуоресценції, а при збудженні світлом, з довжиною хвилі 340 нм - збільшення. Однак, 340 нм є вже ультрафіолетовим світлом, і для її використання необхідний мікроскоп з кварцовими лінзами. Оскільки в нашому випадку був використаний звичайний мікроскоп, то друга хвиля була обрана довжиною 390 нм. 360 нм - це ізобестіческая точка зонда Фура -2, тобто флуоресцентне сигнал при збудженні світлом цієї довжини хвилі не залежить від концентрації Ca2 + і є функція лише концентрації зонда.
Вимірювання флуоресценції при збудженні двома довжиною хвиль дозволяє легко розрахувати [Ca2 +] i у клітці за формулою (24):
[Ca2 +] i = Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)
де Кd - константа дисоціації комплексу Фура -2 з кальцієм, R = F360/F390 - поточне відношення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360/F390 | Ca0 - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Ca2 +, Rmax = F360/F390 | Ca - то ж відношення в розчині з високою концентрацією Ca2 +, b = F390 | Ca0/F390 | Ca - відношення флуоресцентних сигналів у низької і високої концентрації Ca2 + при порушенні довжиною хвилі 390 нм. Параметри Rmin, Rmax і b визначали експериментально. Для цього були приготовані базовий розчин (в ммоль/л): KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH = 7.2), Фура -2 - 0.005; розчин з низькою концентрацією Ca2 + готувався без додавання Ca2 + з добавкою EGTA - 10; розчин з високою концентрацією Ca2 + - з добавкою CaСl2 - 10. Відношення величин флуоресценції визначалося в краплях наведених вище розчинів, поміщених на дно експериментальної камери. В результаті для нашої системи Rmin = 0.33, Rmax = 8.9 і b = 12.8. Параметр Кd був взяв з роботи [Grinkiewicz et al, 1985] і дорівнював 224 нмоль/л.
3.3 Фарбування зрізів флуоресцентним барвником
Для введення кальцій - чутливого зонда в клітку, зрізи інкубувати в розчині Тіроде, що містить естеріфіцірованную незаряджену форму барвника Фура-2 ацетоксіметілестер в концентрації 5 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиду з додаванням детергенту Плуронік F-127 (0.02%). У такій формі барвник проникає в клітку, потім ендогенними естеразами ефірні групи відщеплюються, зонд стає зарядженим і залишити клітку не може. Забарвлення проводилася 20 хвилин при температурі 35оС. Концентрація зонда в клітці визначалася шляхом титрування забарвлених клітин розчином барвника, який додавався у позаклітинний розчин. Оцінена таким способом концентрація зонда в клітці була в діапазоні 30 - 70 мкмоль/л.
3.4 Структура експериментальної установки для двох-хвильового виміру концентрації кальцію
Принципова схема установки представлена на малюнку 4. Основними елементами її є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп, ФЕУ, модуль попередньої обробки сигналу та комп'ютер.
Джерелом збудливого світла служить ртутна лампа потужністю 50 ват. Оскільки як кальцій - чутливого зонда використовували індикатор Фура -2 АМ, що є за збудженням двохвильовому (див. вище), то для кількісного визначення [Ca2 +] i необхідно було одночасно індукувати флуоресценцію обома довжиною хвиль. У нашій конфігурації періодична зміна фільтрів збудження була реалізована за допомогою обертання колеса з вмонтованими в нього двома інтерференційними фільтрами 360 і 390 нм. Частота обертання була 5 Гц. Управління системою зміни фільтрів здійснювалося за допомогою кальцій - вимірювального модуля фірми Luigs und Neumann, Німеччина. Цей же модуль був інтерфейсом попередньої обробки.
Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа Axioskop, Zeiss. Поділ потоків збудливого світла та флуоресценції проводилося за допомогою діхроіческого дзеркала. Світло, що пройшло через фільтр для збудження флуоресценції, відхилявся діхроіческім дзеркалом і за допомогою високоаппертурного иммерсионное об'єктива (40 *, апертура 0.75) фокусувався на об'єкті. Флуоресцентний світло проходило через відповідний інтерференційний фільтр і подавався на фотоелектронний помножувач (ФЕУ). Для зменшення рівня шумів фіксована діафрагма (1 мм) була розташована перед ФЕУ. У результаті флуоресцентний сигнал збирався з фокальній площині діаметром 50 мкм, що дозволило значно поліпшити співвідношення сигнал/шум.
Модуль попередньої обробки дозволяв проводити компенсацію автофлуоресценціі і, при необхідності, підсилювати сигнал, після чого він оцифровуються за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA і обробляється комп'ютером за допомогою програм Tida 5.0 і Wintida, розроблених в Гейдельберзі, Німеччина.


Малюнок 4. Принципова схема експериментальної установки для двохвильовому вимірювання кальцію.
3.5 Розчини та зміна розчинів
Під час роботи зі зрізами всі розчини готувалися на основі розчину Тіроде (в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постійно аерірованной газовою сумішшю 95% О2 + 5% СО2 (pH = 7.4). Бескальціевий розчин готувався еквімолярних заміною CaCl2 на MgCl2 та добавкою 1 ммоль/л EGTA, розчини з підвищеним вмістом калію або кофеїну - заміною NaCl на відповідну кількість KСl або кофеїну.
Зміна розчинів проводилася протокою, швидкість якого можна було варіювати від 10 до 20 мл/хв. Обсяг експериментальної камери становив 0.5 мл. Всі експерименти були проведені при температурі (32 ° С).


4. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Аплікація АТФ в більшості нейронів моторної кори (98 з 102) викликає швидке і короткочасне підвищення концентрації цитозольного кальцію [Ca2 +] i. Концентрація [Ca2 +] i досягає свого максимуму протягом 6-8 секунд і потім відновлюється до базального рівня при триваючому присутності АТФ. Відмивання АТФ призводить до відновлення [Ca2 +] i до рівня спокою. Характерний вигляд АТФ - індукованого кальцієвого транзіента представлений на малюнку 5.


Амплітуда АТФ - індукованого кальцієвого транзіента варіювалася в межах від 50 до 450 нМ. Середнє значення викиду [Ca2 +] i викликаного додатком АТФ у концентрації 100 мкМ знаходилася в межах 200-250 нМ.
Спостерігалася доза - залежність амплітуди відповіді від концентрації АТФ в межах від 10 до 2000 мкМ. На малюнку 7 представлена апроксимації експериментальних точок сигма - функцією. Концентрація АТФ, при якій амплітуда відповіді складає половину максимальної, - 220 20 мкМ.

Метою наших досліджень було визначення підтипів пурінорецепторов залучених в генерацію [Ca2 +] i транзіента. Відомо, що АТФ активує кілька типів пурінорецепторов, а саме Р2 пурінорецептори підтипів Р2х і Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а також Са2 + канали плазмалемми (Кришталь, 1983).
З метою забезпечення достовірності отриманих даних, беручи до уваги той факт, що робота проводилася на тонких зрізах мозку, ми провели серію експериментів з придушенням розповсюдження потенціалів дії за допомогою тетродотоксин (TTX). При використанні TTX з'ясувалося, що амплітуда і форма [Ca2 +] i транзіентов не змінюється або змінюється незначно. Отримані результати дозволяють нам припускати, що отримані нами дані відображають процеси, що відбуваються в окремій спостерігається клітці. На жаль ми не мали можливості проводити всі експерименти c тетродотоксин через дорожнечу препарату. Для вивчення характеристик розглянутих пурінорецепторов, що приймають участь у генерації [Ca2 +] i транзіента, застосовувалися наступні протоколи експериментів.
1.
Додаток АТФ в розчині не містить Ca2 +. Видалення кальцію з позаклітинного розчину незначно впливало на кальцієвий транзіент, викликаний аплікацією 10 мкМ АТФ, але в той же час придушував на 45% 7% кальцієвий транзіент викликаний 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).


1.
Для дослідження здатності внутрішньоклітинного Ca2 + депо до перезаполненію ми послідовно аппліціровалі АТФ кілька разів з інтервалом у 60 секунд у звичайному розчині і в розчині не містить Ca2 +. Як видно з малюнка 9 другу аплікація АТФ викликала Ca2 + транзіент меншою (на 30%? 4%) амплітуди в порівнянні з першою (контрольної) аплікацією. Наступні аплікації АТФ розділені 60 ти секундним інтервалом не викликали помітного зменшення амплітуди [Ca2 +] i транзінета в порівнянні з другою аплікацією у стандартному розчині


У бескальціевом розчині - навпаки, друга аплікація АТФ викликала значне зменшення Ca2 + транзіента на 40%? 5% від контролю. Наступні аплікації АТФ в бескальціевом розчині приводили до послідовного зменшення амплітуди [Ca2 +] i транзіента і після двох - трьох послідовних аплікацій сигнал зникав взагалі (малюнок 10). Таке зменшення ймовірно обумовлено виснаженням внутрішньоклітинних депо.


1.
Інгібіція захоплення Ca2 + ендоплазматичним ретикуло тапсігаргіном (спецефіческіх блокатором Ca2 + насоса ЕПР) зменшувало [Ca2 +] i транзіенти, викликані додатком АТФ, на 63%? 5% для концентрації АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Як видно з малюнка 11 додаток тапсігаргіна не впливало на базальний рівень Ca2 + у клітині.
1.
Додаток кадмію в концентрації 50 мкМ, верапамілу в концентрації 100 мкМ і 50 мкМ нікелю оборотно зменшував амплітуду [Ca2 +] i транзіента викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, і 15% сответственно. Дані представлені на малюнку 12.

1.
Додаток різних агоністів пурінорецепторов викликало різні за амплітудою відповіді. Порядок відносної активності лігандів для даного об'єкта був таким ATP? S? ATФ (АДФ???,?-Methylene ATP? AMФ? УТФ?? Аденозин (ADO), дані преставлени на малюнку 13.


1.
Сурамін, відомий антагоніст Р2 типу пурінорецепторов, зменшував [Ca2 +] i транзіенти, викликані додатком 100 мкМ АТФ на 76%? 7% і також не змінював концентрацію [Ca2 +] i у спокої. Дані представлені на малюнку 14.




5. ОБГОВОРЕННЯ
При дослідженні середніх верств неокортексу щурів ми знайшли їх здатність відповідати на додаток АТФ. Таким чином ми можемо зробити висновок про наявність в даному об'єкті пурінорецепторов. Відповідь на АТФ є доза - залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ. Послідовні програми АТФ, після другого додатки, не викликали зменшення амплітуди [Ca2 +] in транзіентов. З цього можна зробити висновок про відсутність десенсітізаціі даного типу рецепторів.
Досліджуючи джерела підвищення цитозольного кальцію ми виявили, що АТФ активує як іонотропние так і метаботропние рецептори. Блокатори потенціал - керованих кальцієвих каналів такі як кадмій, нікель і верапаміл зменшували АТФ - індуковані кальцієві транзіенти на 35% - 15%, що говорить про опосередкованому АТФ активуванні потенціал - керованих каналів.
Для дослідження активацію метаботропних рецепторів. Для цього ми докладали АТФ в бескальціевом розчині, - амплітуда відповіді при цьому зменшувалася на 45%? 7%. Цей результат говорить про те, що внутрішньоклітинні депо беруть участь у генерації [Ca2 +] in відповідей, причому їх внесок близький до половини. При повторних аплікаціях АТФ в бескальціевом розчині Ca2 + відповідь зникав повністю після другої аплікації, тобто внутрішньоклітинні депо повністю виснажуються. Досліджуючи шлях вивільнення внутрішньоклітинного кальцію ми аппліціровалі тапсігаргін - спецефічні блокатор АТФ - ази ЕПР. [Ca2 +] in транзіенти зменшувалися на 63%? 5% у присутності тапсігаргіна. Аплікація коффеіна, агониста ріанодінових рецепторів, в клітинах моторної кори 14 денних щурів не викликали підвищення рівня [Ca2 +] in. Отже викид [Ca2 +] in з внутрішньоклітинного депо відбувається за IP3 - чутливого механізму.
У подальшому ми досліджували більш докладно типи присутніх пурінорецепторов. Побудувавши ряд активності агоністів для Р1 і Р2 пурінорецепторов по амплітуді відповідей, ми зробили висновок базується на відсутності відповіді на аденозин, що в нашому об'єкті присутні тільки Р2 пурінорецептори. Проводячи подальшу субклассіфікацію Р2 типу рецепторів ми використовували сурамін - блокатор деяких типів Р2х і Р2у рецепторів. Додаток сураміна зменшував амплітуду [Ca2 +] i транзінета викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 76%? 5%, що говорить про наявність цих типів рецепторів у досліджуваному об'єкті.


6. ВИСНОВКИ
1. Додаток АТФ в різних концентраціях викликає Ca2 + транзіенти в клітинах моторної кори щурів.
2. Відповідь на АТФ є доза - залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ.
3. АТФ активує як іонотропний так і метаботропние шляхи підвищення внутрішньоклітинного кальцію.
4. У генерації АТФ індукованого підвищення [Ca2 +] in беруть участь деякі типи потенціал - керованих кальцієвих каналів.
5. Вивільнення внутрішньоклітинного кальцію відбувається з IP3 чутливих депо.
6. У даному об'єкті присутнє тільки Р2 підтипи пурінорецепторов.
7. Сурамін - антагоніст Р2Х2 і Р2Х5 і Р2У рецепторів зменшує амплітуду [Ca2 +] in транзіенти, що говорить присутності деяких з перерахованих вище рецепторів.


7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. A. Shmigol, A. Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology (London), 489.3 627-636.
2. A. Shmigol, G. Isenberg, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-induced Ca2 + release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7, Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.
3. A. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A. Verkharatsky. (1995): "Incremental" caf