Виборче пошкодження інтерстиціальних клітин Кейждела (ВКК) метиленовим синім світлом і веде до втрати повільних хвиль.
нкубація в 50 ммоль метиленового синього (МС) і подальша інтенсивна ілюмінація призводить до зникнення активності повільних хвиль в ВКК пахвовій шару циркулярних м'язів в препаратах товстого кишечнику собак. Це часто супроводжується зниженням потенціалу спокою мембран. Реполяризації клітини до вихідних-70мВ не відновлює активність повільних хвиль, що вказує на те, що МС безпосередньо перериває освіта повільних хвиль. Після інкубації МС, 2-х хвилинна ілюмінація змінює конформацію мітохондрій в ВКК від дуже конденсованої до ортодоксальної, без індукування будь-яких інших видимих змін до гладком'язових клітинах. Після 4-10 хвилинної ілюмінації, ВКК починають прогредієнтності руйнуватися збільшеними і розірваними мітохондріями, втрачають цитоплазматичну контрастність і детальність, з'являються розриви плазматичних мембран. У той же час не виявляються пошкодження в гладком'язових і нервових клітинах. Ультраструктури сполучних щілин зберігається. Інтенсивна ілюмінація без преінкубаціі МС призводить до втрати повільних хвиль, при цьому не порушується УЛЬТРАСТРУКТУРА в препаратах ВКК. У препаратах гладких м'язів, без пахвовій шару ВКК, МС і світло не змінюють електричної активності. Автори вважають, що кореляція між виборчим пошкодженням пахвових ВКК та виборчої втратою активності повільних хвиль вказує на те, що ВКК грають незамінну роль у генерації повільних хвиль.
Концепція регуляторної ролі інтерстиціальних клітин Кейджела у функціонуванні желудочнокишечного тракту (ШКТ) вперше була висунута Stach в 1972 (30), Duchon et al. У 1974 (6), і Faussone-Pellegrini в 1977 (9). І тільки в 1982 році була висунута гіпотеза - ВКК грають роль у генерації ауторітмічності шлунково-кишкового тракту (Thunberg). Очевидність того, що ВКК сприяють генерації активності синусового вузла і наступної генерації повільних хвиль було встановлено на ряді тканин, включаючи тонкий кишечник і товстий кишечник. Важливо і те, що ВКК виявляються в тих областях (пахвові сплетення товстого кишечнику), де утворюються повільні хвилі.
У товстому кишечнику собак, очевидність ролі ВКК в генерації активності синусового вузла випливає з наступного:
1. Коли мережі ВКК видаляються, шар циркулярних м'язів (ЦМ) не може генерувати активність повільних хвиль
2. У дуже тонких препаратах, що складаються з мережі ВКК і пов'язаних з ними гладком'язових клітин, постійно записуються спонтанні повільні хвилі.
Автори показали, що електрична активність записана на поверхні пахвовій шару - наслідок електричного взаємодії між тілом ЦМ і пахвовій мережею ВКК разом з гладком'язовими клітинами (ГМК). У результаті зайвих пар ВКК до ГМК за допомогою сполучних щілин, роль кожного типу клітин в генерації повільних хвиль не може бути визначена точно в електрофізіологічних дослідженнях із застосуванням ізольованих м'язових клаптів.
До появи електронної мікроскопії, більшість селективних методів для розпізнання ВКК грунтувалися на здатності останніх акумулювати барвник МС поза фізіологічних умов. В залежності від умов МС може первинно зв'язуватися ВКК або нервової тканиною. У пршлом ідентифікація ВКК з використанням прижиттєвого фарбування МС застосовувалася тільки на тонкому кишечнику мишей, гвінейських свиней та кролів. У свіжих публікаціях, автори демонструють здатність акумуляції ВКК товстого кишечнику собак. У тому ж дослідженні, автори показали, що в пригніченому світлі МС не викликає змін ультраструктур в забарвлених ВКК і знчітельно не змінює повільних хвиль.
попередньому дослідженні, автори з'ясували, що активність повільних хвиль тонкого кишечника мишей зникає, коли селективно пофарбовані ВКК освітлюються. Більш того, ілюмінація МС-забарвлених ВКК в культуріруемих шматочках тонкого кишечника мишей приводила до втрати спонтанної ритмічної контрактільной активності, це ефект був оборотним на короткий період при ілюмінації низької інтенсивності, але незворотнім в інших випадках.
Завданням авторів було виявити метод специфічного пошкодження ВКК товстого кишечнику собак. Фототоксіческіе властивості МС використовувалися для вивчення ймовірних ефектів на активність повільних хвиль і зміни ультраструктури різних типів клітин пов'язаних з пахвовій мережею ВКК.
МЕТОДИ.
Тканини та препарати.
Собаки обох статей було вбито передозуванням калієвої солі фенобарбіталу (100 мг/кг). Приблизно 5 см проксимального відділу товстої кишки було взято від кожної собаки, відступивши 5 см дистальнее від ілеоцекального зчленування. Потім товстий кишечник відкривався подовжнім розрізом. Потім очищений сегмент прикріплювався до дна діссекціонной чаші Сільгарда наповненою постійно оксигенований (95% кисню і 5% СО2) розчином Кребса.
Щоб вивчити специфічність дії МС і світла, автори досліджували дії МС і світла і на препаратах ВКК-ЦМ (пахвова мережа ВКК та ЦК) і на препаратах ЦМ (ЦМ, відділені від пахвовій шару ВКК і гладких клітин.
Приблизно 2 кв. мм. Тканини, з пахвовій поверхнею, зверненої вгору прикріплювався до дна переносного утримувач. Потім ткан була розрізати вздовж прикріплених країв, виключаючи один край, де була вирізана смуга довжиною 10 мм, шириною 3 мм уздовж довгої осі ЦМ клітин. Вільний кінець смуги був узятий на хірургічний шовк (0,5 мм в діаметрі). Держатель переміщали в розділену камеру причому прикріплену тканина - в записуючу камеру, вільний кінець у стимулюючу камеру. Вільний кінець також з'єднували з сильним перетворювачем.
Ліки та розчини.
Всі розчини спроваджували у роздільну камеру були нагріті до 37 гр і оксигенований киснем 95% - СО205%. Склад розчину Кребса був такий: 120,3 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 20,2 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 і 11,5 глюкози. МС (сигма) був расстворен в розчині Кребса.
Внутрішньоклітинні запису.
Внутрішньоклітинні записи були зроблені мікроелектродами мали піковий опір 30-50 му. Мікроелектроди були заповнені 3 М KCl. Заповнені мікроелектроди підключалися до власника сполученого з електрометрії. Дані електрометрії позначалися на осцілоскопе і записувалися на принтер. Електричні імпульси подавалися на м'язовий клапоть. Сила електричного поля позначалася на осцілоскопе і записувалася на принтері. М'язові клапті підлягають впливу імпульсами тривало оксигенований розчином Кребса з частотою 500 мл/година в розділової камері як мінімум 2 години при температурі 37 град перед початком експерименту.
Під час інкубації МС (50 ммоль) інтенсивність світла була низькою. Потім препарати милися розчином Кребса приблизно 5 хвилин. Препарати ілюмінацію оптичними волоконними лампами (максимальна інтенсивність склала 50 мВ/кв.см. Поверхні тканини віддаленої від джерела світла на 3,5 см). інтенсивність світла вимірювалася цифрової фотометрії. Після експерименту клапті негайно поміщали в формалін.
Світлова та електронна мікроскопія.
Після експериментальної процедури Сільгард відокремлювали отдержателя з тканиною, фіксованого формаліном. Шматки зберігалися при температурі 4 град. Кожен клапоть ділили на 4-6 шматочків тканини. Перед подальшою процедурою ступінь зв'язування МС визначалася Стереомікроскопи. Потім тканину милася 0,1 м фосфатним буфером, фіксувалася 2% осміческой кислотою в 0,1 М фосфатному буфері протягом 1 години. Ультратонкі зразки фіксувалися спиртовим ацетатом сечової кислоти і досліджувалися в електронному мікроскопі.
Статистичний аналіз.
Статистична значимість даних внезавісимості від різних умов була встановлена Student's тестом.
Результати.
Електрофізіологічні дослідження.
Ефекти світла на МС пофарбовані ВКК-ЦМ препарати. Інкубація ВКК-ЦМ препаратів в 50 ммоль МС + 45 хв деполяризація клітин підвищують тривалість повільних хвиль. Щоб зменшити неспецифічні екстрацеллюларние ефекти МС вчасно ілюмінації, тканина милася розчином Кребса. Під час цього усувалися ефекти МС на активність повільних хвиль. Ця частина експерименту виконувалася у пригніченому світі.
Після інкубації в ІМС і миття інтенсивна ілюмінація скасовували активність у ВКК-ЦМ препаратах. Скасування меделнних хвиль супроводжувалася деполяризації клітин до мембранних потенціалу -47 мВ (коливання від -64 мВ до-42мВ). Спільно цього зникли фазові скорочення і тонус клаптя підвищився. Активність повільних хвиль не дивувалася, коли ВКК-ЦМ препарати ілюмінацію з максимальною інтенсивністю на протязі 10 хвилин без попередньої інкубації в МС.
Скасування повільних хвиль не було прямим ефектом деполяризації з того моменту, як реполяризації не відновлювали активність повільних хвиль, навіть коли реполяризації застосовувалася до того, як амплітуда повільних хвиль повністю зменшувалася. Ці спостереження вказують на те, що ефекти МС і світла на механізм створення активності повільних хвиль не залежать від мембранного потенціалу. На противагу цьому зміни активності повільних хвиль, викликані підвищенням позаклітинної концентрації калію залежать виключно від деполяризації, як тільки реполяризації м'язових клаптів повністю зверне ефекти. Крім цього, скасування активності повільних хвиль може бути виявлене при деполяризації лише потенціалом 8-12 мВ (повільні хвилі скасовуються при величинах мембранних потенціалів -60,4 мВ).
короста, з якою скасовувалися повільні хвилі варіювала безпосередньо з інтенсивністю світла. При ілюмінації з максимальною інтенсивністю, повільні хвилі зникають в межах 0,8-3 хвилин. Зменшення інтенсивності світла підвищує тривалість проміжку зникнення повільних хвиль до 3-12 хвилин.
ремя необхідне для зникнення повільних хвиль також залежить від тривалості інкубації в МС. Коли препарати ВКК-ЦМ інкубувати в МС протягом 7 хвилин з наступним періодом прмивкі 5 хвилин, ілюмінація з максимальною інтенсивністю усувала повільні хвилі через 4-8 хвилин (n = 5). Ефекти МС і світла були необоротні.
ффекти МС і світла на ЦМ препарати: Специфічність дії МС вивчалася з використанням ЦМ препаратів, які не містять пахвовій мережі ВКК. Інкубація в МС протягом 45 хвилин не викликала ефектів на електричних параметрах препаратів ЦМ, що перебувають у спокої (мембранний потенціал спокою =- 62,8 мВ), так само не було ефектів при ілюмінації з максимальною інтенсивністю протягом 6 хвилин (n = 4) , що було вдвічі більше максимальної кількості часу, необхідного для скасування повільних хвиль в ВКК-ЦМ препаратах в тих же умовах.
Беручи до уваги той факт, що здатність препаратів ВКК-ЦМ до генерації повільних хвиль була вибірково усунена МС і світлом, подібна активність ЦМ препаратів не була усунена. Після обробки МС і світлом і промивання розчином Кребса, додавання BaCl 2 (0,5 мМ) і BAY K 8644 (0,1 мМ) знижує мембранний потенціал спокою до -46,1 мВ і викликає появу шіпоподобих потенціалів з частотою, амплітудою і тривалістю відповідно: 18,7 циклів/хв; 16,5 мВ; 1,6 с. Частота потенціалів дії була знижена, коли клітини були реполярізовани потенціалом величиною 8-12 мВ і повністю скасовувалася реполяризації клітин до тієї ж величиною потенціалу спокою яким він був у розчині Кребса. Ці спостереження були типові для ЦМ препаратів у присутності BaCl2 і BAY K 8644.
Структурна кореляція.
Світлова мікроскопія. Інкубація в 50 ммоль МС протягом 7 хвилин не викликала видимого вбирання барвника клаптями (n = 12), в той же час 45 хвилинна інкубація призводила до виразно фарбування всіх клаптів (n = 1 -). Ці зразки були виразні особливо в ділянках, що де резидуальный підслизовий шар був дуже тонким. У перших експериментах автори встановили повну втрату офарблюються ВКК, коли внутрішня поверхня ЦМ шару була витягнута з препарату разом з підслизової сполучною тканиною. Ось чому у всіх експериментах, субмукоза була відділена якомога повніше ножицями, з мінімальним механічним розтяганням.
Після 45 хвилинної інкубації МС фарбування було також виявлено крім ВКК і невеликої кількості аксонів, в еритроцитах всередині капілярів і венул, в тучних клітинах у субмукозе і в інтерстиції ЦМ. Гладком'язові клітини не забарвлювалися. У 1мм зрізах ЦМ були контрастні у всіх МС забарвлених клаптів, що визначалося недостатньою кількістю клітин. Тканини добре зберігалися. ХотяІКК-ЦМ препарати, які були преінкубіровани МС протягом 7 хвилин не показали видимого фарбування, контрастність пахвовій ВКК шару зменшувалася після ілюмінації з максімальниой інтенсивністю протягом 4010 хвилин як було встановлено у випадку фарбування толуідіном синім. Ці спостереження корелювали з ультраструктурних змінами.
Електронна мікроскопія: Контрольні дані - ілюмінація без МС ультраструктурних ніяких змін не було виявлено в ВКК-ЦМ препаратах (n = 11, 2-10 хв ілюмінація), які висвітлювалися на протязі 10 хвилин з максимальною інтенсивністю без інкубації в МС. Три типи клітин, інтимно пов'язаних щілинними з'єднаннями і промежеуточнимі контактами були присутні уздовж усього внутрішнього краю препаратів. ВКК з'єднуються з тонкими гіллястими гладком'язовими клітинами (ВКМК), які в свою чергу формують щілинні контакти і проміжної з'єднання з глибоко лежать великими клітинами ЦМ.
Взаємодія між цими типами клітин було важливим, оскільки автори виявили, що фарбування МС і помітне пошкодження після інкубації в МС і ілюмінації були обмежені для ВКК, більш ніж для ВГМК і типових гладком'язових клітин. Хоча індивідуальний профіль клітинних відростків часто було неможливо класифікувати, то три типи клітин можуть бути класифіковані порівнянням ядерних частинок клітин:
1. ВКК були високо розгалуженими клітинами з 2 або 5 первинними відростками, профілі клітин, які включали ядро, у соновном також містили початок 1 або 2 первинних відростків. Перінуклеарная цитоплазма між початком відростків була дуже тонкою. На початку відростків перінуклеарная цитоплазма домінувала великий акумуляцією мітохондрій. Частина цитоплазми була зайнята вузлами філамент з малими тільцями асоційованими з цитоплазмою і мембраною. Коли останні порівнювалися з розташуванням щільних тілець в гладком'язових клітинах (ЦМ і ВГМК), виявилося, що в цитоплазмі ВКК їх мало. Розкидані мікротубули завжди були присутні в перінуклеарной цитоплазмі. Великий ендоплазматичний ретикулум складався із системи переплітаються, з'єднаних між собою цистерн, організованих частково між і навколо мітохондрій, частково з'єднаних з тонкими цистернами. Цистерни були переважно тонкого типу, з грубої частиною, яка характеризується широко розкиданими рибосомами.
2. Вище перераховані риси були типові для ВКК, але не для ВГМК або ЦМ. У ВГМК та ЦМ мітохондрій було менше і вони були безладно розкидані. Профілі подібні до тих, що зображені на фотографіях 5а і 6а були типові у випадку, якщо щільність мітохондрій в ВГМК менше відповідної величини в ВКК. Перінуклеарная цитоплазма була заповнена щільно розташованими філаментах (тонкого, товстого та проміжного типів) зі схожою структурою щільних тілець (асоційовані з цитоплазмою і мембраною) в ВГМК та ЦМ. ВГМК може бути відмінний від ЦМ розміром (більш тонкі області перінуклерних філамент і більш тонкі відростки в ВГМК) і нерегулярним появою гіллястість в ВГМК. Ядерна морфологія була схожою в ВКК, ВГМК та ЦМ.
Хоча можуть виявлятися деякі варіації ультраструктур при огляді полусерійних зрізів, профілі великих відростків трьох типів клітин в загальному можуть бути класифіковані за критеріями перерахованим вище.
льтраструктура після інкубації в МС.
Цілісна структура клітин і субклітинні деталі не дивувалися МС як вказувалося раніше. Після 7 хвилинної інкубації в МС, в усіх 3 типи клітин не виявлялося будь-яких змін. Єдиною постійною зміною, що спостерігався в усіх препаратах був перехід мітохондрій від конденсованої (розширені внутрікрістовие простору і щільний матрикс) до ортодоксальної конформації (вузькі Крісті і розріджений матрикс) в ВКК. На противагу цьому, у гладких клітин мітохондрії перебували в різній конформації до і після обробки МС і світлом. Ніяких доказів на користь конформації мітохондрій?? в гладком'язових клітинах (ГКР) отримано не було.
Після інкубації в МС ілюмінація протягом 4 і 10 хвилин викликала серйозні пошкодження в ВКК і малій кількості ГКР розкиданих по краю пахвовій шару. Після 4 хвилинної ілюмінації найвидатнішими змінами в ВКК були збільшення мітохондрій і збільшення вакуолізація цитоплазми (n = 3). Після 10 хвилин ілюмінації (n = 3, фотографії 6в) ВКК були збільшеними мали низьку контрастність цитоплазми, відмінно помітні мітохондрії, кілька кавеол і отвори в плзматіческіх мембранах, що ймовірно говорило про її розрив. Ідентифікація ВКК була можливою завдяки збереженню базальної пластинки і спільно з рисами цитоплазми (такими як число мітохондрій) та збереження взаємозв'язків з глубоколежащімі клітинами.
ОБГОВОРЕННЯ.
збірательное пошкодження товстокишковій ВКК метиленовим синім і світлом.
друге встановили сувору очевидність того, що пахвові ВКК незамінні в генерації потенціалів дії повільних хвиль в ЦМ товстого кишечнику собак безпосередньо показавши зв'язок між виборчим пошкодженням ВКК і зникненням повільних хвиль при цьому. У свіжих дослідженнях автори показали, що ВКК в пахвовій сплетенні вибірково акумулюють МС і що МС не викликає будь-яких мікроскопічно помітних змін до будь-яких типах клітин, крім він не має значного ефекту на активність повільних хвиль. У цьому дослідженні автори показали, що інтенсивна ілюмінація після інкубації в МС призводить до специфічного пошкодження ВКК підтверджуваного елетронній мікроскопією. Більше того, коли ЦМ препарати, у яких були видалені пахвові ВКК-ГМ мережі, були інкубувати в МС з наступною ілюмінацією, спонтанна і індукована електрична активність не зачіпали. Ці спостереження вказують на те, що ефекти МС і світла на ВКК-ЦМ препарати були специфічні тільки для ВКК, не пов'язаних з ГМК.
Хоча усунення активності повільних хвиль МС і світлом супроводжувалося деполяризації, остання не була відповідальна за інгібування активності повільних хвиль, з того моменту, як реполяризації клітин до їх як і раніше, потенціалу спокою не відновлювала повільні хвилі. Крім того, було відмічено, що повільні волниустраняются у великому діапозоні величин мембранних потенціалів, включаючи мембранний потенціал спокою, властивий циркулярним м'язам, що вказує на, що зміни активності повільних хвиль не викликані змінами величин мембранних потенціалів. На противагу цьому, строфантин також деполярізует мембрани і при цьому усуває активність повільних хвиль (1). Тим не менше, реполяризації мембран до споконвічного потенціалу спокою повністю відновлює активність повільних хвиль. Це вказує на те, що в присутності строфантину, інгібування актівностімедленних хвиль - безпосередній ефект деполяризації.
Локалізація акумуляції МС всередині ВКК дуже специфічна. Коли преципітації МС була проведена так, що вдалося уникнути переміщення і освіти грубих преципітат було виявлено, що електронно-щільні депозити присутні тільки в ЕПР (ЕР) і його немає в інших цітоплазматічексіх компонентах (35). Це може вказувати на те, що МС входить в ЕР безпосередньо шляхом проникнення через пгладкіе цистерни. Проте, залишається незрозумілим чому МС накопичується в ЕР ВКК, але за тих же обставин не входить в ЕР ГМК. У досвідчених умовах цього дослідження, зміни до конформації мітохондрій так само як активності повільних хвиль були виявлені при мінімальній інкубації МС протягом 7 хвилин і мінімальної ілюмінації протягом 2 хвилин, що наводить на думку про те, що первинною причиною усунення повільних хвиль є пошкодження мітохондрій .
Фотодинамічна цитотоксичну дію МС було відомо багато років (2). Нещодавно вивчалася цитотоксичних ефективність фотоінактіваціі МС-чутливих клітин раку жовчного міхура (10), включаючи і супроводжуючі її ультраструктурні зміни (39). Після короткого періоду ілюмінації (5 хвилин), доповідали, що ультраструктурні зміни були ідентичні даними авторів (дізінтеграція мітохондрій і ранні ознаки пошкодження плазматичних мембран), а висока тривалість ілюмінації вела до розриву мембран клітинної фрагментації. У дослідження фотодинамічної дії МС на ДНК (23) було показано, що оборотні предповрежденія ДНК, викликані МС в темряві стають незворотними коли до інкубації в МС приєднується ілюмінація. Ось і в цьому дослідженні електрофізіологічні ежффекти і ультраструктурні ефекти МС і світла також були незворотними.
оль ВКК в генерації повільних хвиль.
астоящее дослідження підкріплює гіпотезу про те, що ВКК незамінні для генерації активності водія ритму в кишечнику. У подібних дослідженнях, що використовують тонкий кишкові мишей ілюмінація світлом червоного лазера усувала внутрішньоклітинно записану активність повільних хвиль після інкубації в МС (36). Було показано, що активність повільних хвиль уражається в препаратах де ВКК забарвлювалися МС і не дивується, де ВКК не забарвлюється. В іншому дослідженні (37), спонтанна скорочувальна активність повільних хвиль була збережена, коли в культуріруемих шматочках мускулатури тонкого кишечника мишей пофарбовані МС ВКК були переглянуті під мікроскопом в дуже тьмяному світлі, але ці шматочки швидко ставали нерухомими при сильному освітленні.
Справжнє ісследованіеспеціфіческі встановлює вирішальну роль ВКК в генерації повільних хвиль в товстому кишечнику собак як показувалося перш (12,18,19,21,29). Автори висувають гіпотезу про те, що циклічна внутрішньоклітинна активність періодично активує струми водія ритму. У цьому випадку ВКК можуть бути або біохімічними годинами або одночасно біохімічними годинами і іонними каналами, що відповідають за генерацію струму водія ритму. Хоча спонтанні осціляціі, записані в ізольованих ГМК (25) і клітинах близьких за описом до ВКК (17,26), і усувалися блокаторами кальцієвих каналів L-типу і отже не відображають повільні хвилі, як компонент водія ритму, які в принципі цими блокаторами НЕ усуваються (14). Таким чином, спонтанно що відбуваються осціляціі не мають характеристик повільних хвиль.
ледующій запитання стосується ролі ГМК в генерації повільних хвиль, як компонента водія ритму. Гіллясті ГМК, які інтимно соедіняютс з ВКК з'єднувальними щілинами становлять особливий інтерес. Якщо ВКК єдині клітини відповідальні за генерацію токо водія ритму, то величина струму, яку кожна ВКК повинна генерувати, щоб деполярізіровать всі сусідні з нею клітини з високим опором поверхні, повинна бути величезною. Можливо й інше: ВКК - це біохімічні годинник і ВКК посилають внутрішньоклітинні метаболіти через сполучні щілини в інтимно з'єднані з ними ГМК. Завдяки такій метаболічної зв'язку (8) асоційовані ГМК можуть перебувати в синхронії з ВКК, коли канали водія ритму і в ВКК і в асоційованих з ними ГМК - активовані. Обгрунтування цієї частини гіпотези вимагає ідентифікації каналів водія ритму і докази існування таких каналів у ВКК і ГМК. Цікавий той факт, що в присутності тетраетіл амонію, BaCl2 і карбохола, ізольований шар ЦМ без пахвовій робочої мережі ВКК-ГМК генерує потенціали дії, які є ідентичними за частотою з повільними хвилями, але усуваються блокаторами кальцієвих каналів L-типу (D-600) ( 18). Це і подальше дослідження (20) показали, що ЦМ без пахвовій робочої мережі ВКК-ГМК може генерувати потенціали з подібними характеристиками активності повільних хвиль.
Активність повільних хвиль також зникає після обробки тканин Родаліном 123 в полнослойних препаратах м'язів (38). Родалін 123 - специфічний маркер мітохондрій, і таким чином він не специфічний для ВКК, хоча ВКК особливо багаті мітохондріями. Після проникнення в мітохондрії, Родалін 123 стає цитотоксичних завдяки руйнуванню АТФ (24). Отже, ефект Родоліна 123 наводить на думку про те, що активність повільних хвиль знаходиться в суворій залежності від внутрішньоклітинного метаболізму. Це узгоджується зі спостереженнями про те, що активність повільних хвиль чутлива до високих температур (1), блокується інгібіторами метаболізму, такими як дінітрофенол і карбоніл ціанід (H. Preiksaitis і JD Huizing, неопубліковані дані) і уражається при зміні конформації мітохондрій (справжнє дослідження) . Це підтримує гіпотезу авторів про те, що компонент повільних хвиль водія ритму утворюється завдяки внутрішньоклітинного метаболізму.
Таблиці, графіки та зображення.
Таблиця 1. Ефекти інкубації в 50 мМ метиленового синього (45 хвилин) на електричну активність препаратів ВКК-ЦМ з або без ілюмінації
араметри
У розчині Кребса
+ Метиленовий синій
+ Світло
Мембранний потенціал спокою, мВ
-72,8 + -0,8
-70,6 + -0,9
-47,3 + -1,9
-69,7 + -1,6
Частота, циклів/хвилину
5,3 + -0,2
5,0 + -0,2
Тривалість, з
Амплітуда дії, мВ
3,8 + -0,3
38,6 + -1,4
4,9 + -0,7
37,4 + -1,5
Амплітуда плато, мВ
34,1 + -1,3
33,2 + -1,6
Частота коливань, мВ/c
192,3 + -23,8
169,4 + -18,7
Графік 1. Електрофізіологічні ефекти ілюмінації на пофарбовані МС препарати ВКК-ЦМ.
А: МС (45 хвилинна інкубація) дещо знижує мембранний потенціал спокою і збільшує тривалість повільних хвиль. Ці ефекти зникають після промивання препаратів від МС в розчині Кребса протягом 5 хвилин. Препарти потім висвітлювалися з максимальною інтенсивністю. У подальшому, амплітуда повільних хвиль знижувалася при цьому мембранний потенціал спокою зменшувався до-44мВ. Реполяризації мембрани не встановлювати активність повільних хвиль, що вказує на те, що усунення повільних хвиль є наслідком інгібування механізму генерування повільних хвиль і не викликана деполяризації.
В: Зменшення інтесивності світла на 1/3 від того, що було в досвіді А значно подовжує період ілюмінації, необхідний для усунення повільних хвиль. У цьому експерименті спостерігалися повільні хвилі більшої тривалості під час періоду деполяризації. Повільні хвилі усувалися при величиною мембранного потенціалу спокою -42 мВ.
Графік 2. Ефекти мембранного потенціалу на активність повільних хвиль.
А: після 45 хвилинної інкубації в МС і промивання в розчині Кребса, препарати висвітлювалися з 1/3 максимуму інтенсивності до тих пір поки амплітуда повільних хвиль не стане дорівнює половині такої в розчині Кребса. Препарати були реполярізовани до такого ж мембранному потенціалу спокою як і в розчині Кребса. У даному випадку відновлення амплітуди повільних хвиль не спостерігалося.
В: в противагу цьому, у разі коли деполяризація була викликана підвищенням позаклітинної концентрації К + до 15 мМ в розчині глюкамін-нітрендіпін-Кребса, реполяризації препаратів ВКК-ЦМ з використанням методу анологічному в досвіді А повністю відновлювала амплітуду повільних хвиль. Крім того, амплітуда повільних хвиль також відновлювалася після промивки.
Таблиця 3. Усунення активності повільних хвиль МС + світло без помітної деполяризації. Повільні хвилі усувалися в МС забарвлених препаратах ВКК-ЦМ з освітленням 1/3 максимуму інтесивності світла протягом 8,5 хвилин. Повільні хвилі Повільні хвилі усувалися при величині потенціалу -64 мВ, що дорівнює істинною величиною мембранного потенціалу спокою препаратів циркулярних м'язів в розчині Кребса. (див. Графік 4)
Таблиця 4. Електрофізіологічні ефекти МС + світло на препарати ЦМ. Препарати ЦМ, позбавлені пахвовій мережі ВКК та кількох прилеглих шарів ГМК були спонтанно помежени в розчин Кребса. Інкубація в 50 мМ МС не викликала змін мембранного потенціалу, чого не зробила і 3 хвилинна ілюмінація з максимумом інтенсивності. Було показано, що препарати ЦМ життєздатні при стимуляції 0,5 мМ BaCl2 + 0,1 BAY K 8644.
Зображення 5.
А: електронна мікрофотографія підслизового краю в контрольній тканини. Ілюмінація з максимальною інтенсивністю на протязі 10 хвилин без преінкубаціі в МС не має ефектів на ультраструктури ВКК (мітохондрії не конденсована), тонкі нерегулярні гіллясті гладком'язові клітини (ВГМК), нерви (Н) і власне циркулярні м'язи (ЦМ).
SUB: підслизова
В і С: зверніть увагу, ВКК після інкубації в МС на протязі 45 хвилин, без подальшої ілюмінації (В) або з 2 хвилинної ілюмінацією з максимумом інтенсивності (С) зазнали зміна конформації мітохондрій від конденсованої в ортодоксальну. На відміну від цього, УЛЬТРАСТРУКТУРА збережена, включаючи щілинні контакти (ЩК).
Зображення 6. Тканина інкубувати в МС протягом 7 хвилин з наступною ілюмінацією максимумом інтенсивності протягом 2 (А) і 10 хвилин (В).
А: після 2 хвилинної ілюмінації єдині ультраструктурні зміни - це поява мітохондрій з ортодоксальної конформацією (порівняйте з зображенням 5С: 45 хв в МС, 2 хв у світі).
