Генетична інженерія та біотехнологія

Вертьянов С. Ю.

Генетична інженерія (ГІ) - сукупність методів, що дозволяють штучно переносити генетичну інформацію з одного організму в інший за допомогою спеціально створених генетичних конструкцій. Одне із завдань ГІ - одержання організмів з бажаними властивостями. Основним підходом ГИ є конструювання in vitro (поза організмом) рекомбінантних молекул ДНК (штучно скомбіновані з фрагментів) з заданими спадковими властивостями, тому ГИ також називають технологією рекомбінантних ДНК. Організми, в які за допомогою методів ГИ введені невластиві їм гени, носять назву трансгенних.

Основні принципи ГИ

Бурхливий розвиток ГИ почалося після 1970 р., коли з клітин бактерій навчилися виділяти рестріктази - ферменти, що захищають бактерії від бактеріофагів. Впізнаючи в чужорідної ДНК специфічний для кожної рестріктази сайт (послідовність з 4-6 нуклеотидів), рестріктази роблять на цьому сайті розриви обох ланцюгів ДНК. У результаті чужорідна ДНК виявляється розрізаної на фрагменти і нефункціональною. На сьогодні відомо близько 3500 рестріктаз. Наприклад, рестріктаза Eco RI ( "еко-ер-один") з кишкової палички (Escherichia coli) дізнається сайт ГААТТЦ:

В результаті ступеневої розрізу утворюються фрагменти ДНК з виступаючими однониткових кінцями, комплементарними один одному. Ці кінці можуть знову з'єднуватися, тому їх називають "липкими кінцями". Якщо взяти ДНК, наприклад, людини і моркви, обробити однієї і тієї ж рестріктазой і змішати, то фрагменти ДНК моркви і людини будуть з'єднуватися липкими кінцями. Але така зв'язок буде нетривкою: водневі зв'язки між всього лише чотирма парами підстав можуть легко розійтися. Злиплі фрагменти ДНК можна зафіксувати, якщо додати в розчин ДНК-лігази (другий за значимістю фермент ГІ), що зшиває ланцюга ДНК, розрізані рестріктазой. В результаті вийде стабільна рекомбінантних ДНК.

Далі необхідно зберегти і розмножити отримані рекомбінантні молекули. З цією метою їх вбудовують у спеціальні конструкції, які називаються векторними молекулами ДНК, або векторами. Зазвичай вектори конструюють з бактеріальних плазмід. Типовий вектор включає:

1. Сайт пізнавання певної рестріктазой для вбудовування в вектор цільової ДНК.

2. Ген стійкості до одного з антибіотиків для подальшого відбору клітин, отримали рекомбінантний вектор.

3. Промотор, що забезпечує експресію цільової ДНК.

Наведемо приклад використання вектора для одержання штаму кишкової палички, продукує цільової білок. Для вбудовування в вектор суміш фрагментів цільової ДНК (з геном, кодований цільової білок) і ДНК вектора обробляють спочатку однієї і тієї ж рестріктазой, потім ДНК-лігази. У результаті утворюється рекомбінантний вектор. Для розмноження його вводять в клітини кишкової палички або дріжджів. На поверхні твердої живильного середовища з антибіотиком кожна клітина, несуча рекомбінантний вектор, розмножується і утворює колонію з однакових клітин - клон. Кожна клітина-родоначальниця клону отримала одну молекулу рекомбінантного вектора, яка реплікується і передається всім клітинам колонії. Тому таку процедуру називають молекулярною клонуванням.

Першої реакцією наукової громадськості на створення ГИ-технології було введення обмежень на експерименти з рекомбінантними ДНК. Вчені вважали, що об'єднання генів різних організмів може призвести до появи нового організму з небажаними або навіть небезпечними властивостями. Минуло кілька років, і дослідники переконалися, що їхні побоювання сильно перебільшені. Мікроорганізми, змінені за допомогою генно-інженерних маніпуляцій, у зовнішньому середовищі не витримують конкуренції, оскільки значну частину своїх ресурсів вони витрачають на синтез цільового білка, на шкоду власній конкурентоспроможності.

Досягнення ГИ

З розвитком ГИ вчені отримали можливість синтезувати, виділяти, комбінувати і переміщувати гени і будь-які інші фрагменти ДНК. ГИ внесла революційний внесок в розвиток багатьох біологічних дисциплін: молекулярної біології, мікробіології, вірусології, цитології, ембріології, медичної генетики і генетики людини. З'явилася раніше недоступна можливість вивчення молекулярної організації геномів (у тому числі вищих еукаріотів), що призвело до виникнення геноміки -- розділу генетики, що вивчає структурну організацію та функціонування геномів.

ГИ-методи дозволили реалізувати програми секвенування (визначення повних нуклеотидних послідовностей ДНК) геномів багатьох організмів. Вже секвенувати ДНК сотень видів бактерій, дріжджів, плазмодія, рису, кукурудзи, картоплі, дрозофіли, миші; завершена міжнародна програма "Геном людини".

Щоб чого ж потрібно секвенування геномів? Одна з основних завдань - з'ясувати будову геному і його роботу як єдиного цілого. Повна нуклеотидних послідовність - це попередня карта геному організму. У первісному вигляді це просто довга послідовність нуклеотидів, ні про що не говорять. Для того, щоб з нею можна було працювати, в ній виявляють гени, регуляторні елементи, мобільні елементи та інші послідовності ДНК, функція яких ще не відома. Для медичної генетики важливо нанести на нуклеотидну карту гени, відповідальні за різні хвороби, щоб розробляти методи молекулярної діагностики, шукати способи лікування і запобігання захворювань. На карту людини вже нанесені багато генів спадкових захворювань.

Генна терапія спадкових захворювань людини. Розвиток цієї перспективної області стало можливим після секвенування геному людини. Генна терапія включає наступні етапи:

1. Одержання клітин від хворого (в генній терапії дозволено використовувати тільки соматичні клітини людини).

2. Введення в клітини лікувального гена для виправлення генетичного дефекту.

3. Відбір і розмноження "виправлених" клітин.

4. Вступ "виправлених" клітин в організм пацієнта.

Вперше успішно застосувати генну терапію вдалося в 1990 р. чотирирічної дівчинки, страждає важким імунодефіцитом (дефект ферменту аденозіндезамінази), були введені власні лімфоцити з вбудованим нормальним геном аденозіндезамінази. Лікувальний ефект зберігався протягом декількох місяців, після чого процедуру довелося регулярно повторювати, оскільки виправлені клітини, як і інші клітини організму, мають обмежений термін життя. В даний час генну терапію використовують для лікування більше десятка спадкових захворювань, в т. ч. гемофілії, таласемії, муковісцидозу.

Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

Щоб отримання цільової ДНК в достатніх кількостях для роботи в ГИ широко використовується метод ПЛР, розроблений в 1985 р. Метод дозволяє розмножити в мільйони разів будь-яку ділянку ДНК розміром до 5 тисяч пар нуклеотидів (див. с. 142). Першим практичним використанням ПЛР була розробка тест-системи для діагностики серповидноклітинної анемії (порушені ділянки ДНК розмножували до обнаружімих при електрофорезі кількостей). За допомогою ПЛР отримують фрагменти ДНК для клонування, секвеніруют цільові ДНК, виявляють патогенні віруси або бактерії, а також спадкові захворювання і аномалії. У судовій медицині ПЛР використовують для ідентифікації особи, для встановлення родинних зв'язків. В даний час метод ПЛР став буденною процедурою, повсякденно використовуваної в тисячах лабораторій.

Таким чином, розробка методів ГИ і ПЛР призвела до бурхливого прогресу в біології, але найглибші перетворення відбулися в біотехнології.

Біотехнологія - Галузь науки, що займається промисловим використанням біологічних процесів і живих організмів для виробництва ліків і вакцин, сільськогосподарських і споживчих продуктів.

Біотехнологічні процеси люди використовували з давніх-давен, займаючись хлібопечення, виноробства, пивоварінням, приготуванням кисломолочних продуктів. Сутність цих процесів була виявлена лише в XIX ст. після наукових відкриттів Л. Пастера. Роботи вченого послужили розвитку різних виробництв з використанням мікроорганізмів.

В Наприкінці 1970-х рр.. на стику традиційної біотехнології та ГИ виникла молекулярна біотехнологія. В її основі лежить процедура переносу генів з одного організму в інший за допомогою методів ГИ з метою створення принципово нового продукту чи промислового виробництва вже відомого продукту. Перша фірма, виробляє лікарські з'єднання за допомогою методів ГИ, була створена в 1976 році.

Виробництво лікарських препаратів

Мікроорганізми після введення відповідних генів стають продуцентами цінних для медицини білків. У біореакторах на спеціальних поживних середовищах вирощують бактерії; гриби; дріжджі, які продукують антибіотики; ферменти; гормони; вітаміни та інші біологічно активні сполуки. Наприклад, клітини кишкової палички служать біологічними фабриками з виробництва людського інсуліну. До 1982 р. інсулін отримували досить трудомістким способом з підшлункової залози свиней і забезпечували лише 10% хворих на цукровий діабет. З 1982 р. цією роботою "займається" кишкова паличка і забезпечує інсуліном десятки мільйонів хворих по всьому світу (у тому числі і тих, у кого алергія на тваринний інсулін). Кишкова паличка виробляє людський гормон росту соматотропін (раніше його отримували з трупного матеріалу).

Противірусний препарат інтерферон в організмі людини виробляється у вкрай незначних кількостях. Після виявлення амінокислотної послідовності інтерферону ген був штучно синтезований і вбудований в вектор, потім вектор ввели в клітини бактерії і отримали штам-продуцент інтерферону.

Виробництво генно-інженерних вакцин

Традиційні вакцини виготовляються з вірусів, інактивованих нагріванням або хімічним впливом. Іноді вірус залишається життєздатним і може при вакцинації викликати захворювання. Застосування ГИ-вакцин не має такого недоліку. Наприклад, створений продуцент білка поверхневої капсули вірусу гепатиту. Цей білок достатній для вироблення в організмі людини імунітету проти вірусу гепатиту, і така вакцинація не в викличе інфекцію. В даний час активно ведуться генно-інженерні розробки вакцини проти СНІДу.

Виробництво ГИ-мікроорганізмів, здатних рости на невластивих для них середовищах, відкриває ряд нових можливостей. Такі мікроорганізми використовують для біологічного очищення навколишнього середовища (в т.ч. від нафти і нафтопродуктів). На відходах виробництва нафтопродуктів, гідролізату деревини, на метанолі, етанолі, метан успішно культивують дріжджі. Використання їх в якості кормового білка (дріжджі містять до 60% білка) дозволяє отримувати додатково до 1 млн т м'яса на рік. Ведуться роботи зі створення мікроорганізмів, які виробляють ацетон, спирт та інші горючі матеріали на відходах сільського господарства, лісової і деревообробної промисловості, а також на стічних водах. У майбутньому, за виснаженні ресурсів нафти, цей шлях отримання горючих речовин може виявитися досить актуальним. Створені установки, в яких бактерії переробляють гній у біогаз. З 1 т гною отримують 500 м3 біогазу, що еквівалентно 350 л бензину.

Біотехнологія рослин

Отримані форми рослин з прискореним ростом, більшою масою плодів, збільшеною тривалістю зберігання плодів; стійкі до гербіцидів, до патогенних вірусів та грибів, до шкідливих комах, а також до посухи і засолених грунтів. Рослини продукують для людини вакцини, фармакологічні білки і антитіла. Наприклад, впровадження гена біосинтезу каротину в геном рису дозволило вивести "золотий" рис, багатий цим цінним для людини провітаміном.

В природі існує бактерія Bacillus thuringiensis, виробляє ендотоксин білкової природи, що діє на комах. Ген, що кодує цей токсин, був виділено та вбудований в ДНК картоплі. Такий картопля личинки колорадського жука в їжу вживати не можуть. Аналогічним чином вдалося отримати стійкі до сільськогосподарським шкідників трансгенні форми бавовни, кукурудзи, томатів і ріпаку. Після впровадження в геном винограду гена морозостійкості від дикоростучої капусти броколі трансгенну виноград став морозостійкі. Ця процедура зайняла лише рік. Зазвичай на виведення нових сортів винограду йде 25-35 років.

Істотні посівні площі зайняті під трансгенні рослини в США (68% світових посівів трансгенних культур), Аргентині (22%), Канаді (6%) і Китаї (3%). В основному вирощують трансгенної сої (62%), кукурудзу (24%), бавовна (9%) і ріпак (4 %).

Велике значення в сільському господарстві має виробництво незамінних амінокислот, не синтезуються в організмах тварин. У традиційних кормах їх недостатньо, тому доводиться збільшувати кількість їжі. Додавання в їжу 1 т синтезованої мікробіологічними шляхом амінокислоти лізин економить десятки тонн кормів.

Біотехнологія тварин

Отримання трансгенних тварин починають зі створення генетичних конструкцій, в яких цільової ген знаходиться під контролем промотора, активного в певної тканини організму, наприклад у клітинах молочної залози. Таку конструкцію вводять в запліднену яйцеклітину і поміщають тваринам для виношування. Вихід здорових тварин поки що невеликий (менше 1% ембріонів), але вчені продовжують дослідження. Отримані трансгенні корови, вівці, кози, свині, птахи, риби.

Від 20 трансгенних корів можна одержати до 100 кг цільового білка в рік. Саме стільки білка, що застосовується для запобігання тромбів в кровоносних судинах, потрібно людству щорічно. Для отримання необхідного людям білка-фактора згортання крові (його застосовують для підвищення згортання крові у хворих на гемофілію) достатньо однієї трансгенної корови.

Актуально створення порід домашніх тварин, стійких до паразитів, бактеріальних і вірусних інфекцій. Вбудовуючи гени стійкості до найбільш поширеним захворювань, можна значно заощадити на вакцини і сироватках (до 20% від вартості кінцевого продукту).

трансгенних ссавців використовують як модельних систем для пошуку способів лікування спадкових захворювань людини. На мишах відпрацьовують методи боротьби зі СНІДом, муковісцидоз, хворобою Альтцгеймера, на кроликах - з онкологічними захворюваннями.

Висновки

В результаті застосування біотехнології з'явилися бактерії, рослини, тварини, які є природними біореактора. Вони продукують нові або змінені генні продукти, які не можуть бути створені традиційними методами схрещування, мутагенезу та селекції. Крім того, молекулярна біотехнологія дає принципово нові методи діагностики і лікування різноманітних захворювань. Проте у ряді випадків рекламовані перспективи виявляються перебільшеними і не завжди відповідають реальним можливостям біотехнології.

Сорти, отримані методами класичної селекції, менш вражаючі, але мають свої гідності, вони більш стійкі і надійні у використанні. Якщо класична селекція залишається в природних межах, то сучасні технології, оперуючи на рівні клітин, хромосом і окремих генів, виходять за межі природних закономірностей. Ці методи використовують природні компоненти (клітини, гени і т. д.), але комбінують їх довільно. Можливі побічні ефекти під багатьох випадках важко передбачувані. Необхідні тривалі експерименти на тварин та рослини і серйозні дослідження. Відомо негативне ставлення ЗМІ та широких верств громадськості в різних країнах до продукції молекулярної біотехнології - генно-модифікованим (ГМ) продуктів. Разом з тим стає все більш зрозумілим, що використання методів ГІ - один з можливих шляхів забезпечення продуктами харчування стрімко зростаючого населення планети. Для визначення можливих меж використання методів ГИ важливо розібратися і в моральних аспектах вторгнення людини в світ Божий.

Список літератури

Щоб підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту www.portal-slovo.ru/