Трансгенні рослини і грунтова біота

А.Г. Вікторов, кандидат біологічних наук, Інститут проблем екології і еволюції ім. А.Н. Северцова РАН

Перші стійкі до шкідників рослини, створені за допомогою методів генної інженерії, були введені в культуру в 90-х роках минулого сторіччя. Ці генетично модифіковані рослини (Bt-культури) несуть гени грампозитивної аеробної спороутворюючих бактерії Bacillus thuringiensis, яка синтезує параспоральние (локалізовані поруч зі спорів) кристалічні утворення, які містять d-ендотоксини - Cry-білки, що вбивають личинок комах різних загонів. Зауважу, препарати із суміші клітин, суперечка й параспоральних кристалів застосовуються вже понад півстоліття (перший промисловий інсектицид "Спореін" був створений у Франції в 1938 р.). З тих пір вони вважаються одними з найбільш екологічно безпечних засобів захисту рослин, тому що цей клас пестицидів токсичний для теплокровних тварин лише в концентраціях, у кілька тисяч разів перевищують дози, що використовуються при одноразової обробці полів.

В даний час в сільському господарстві використовується вже близько тридцяти Bt-культур. Найпопулярніші з них - кукурудза, бавовна, картопля, гібрид ріпаку "канола" (від англ. canada oil low acid -- канадське слабокислі масло), рис, броколі, арахіс, баклажан, тютюн. Більшість сортів трансгенної кукурудзи несуть ген білка Cry1Ab, що захищає від небезпечного шкідника - личинок кукурудзяного, або стеблова, метелика (Ostrinia nubilalis).

У 2001 р. генетично модифіковані рослини займали вже більше 12 млн. га в світі, причому близько половини з них доводилося на частку трансгенної кукурудзи. 99% всіх Bt-культур вирощують у чотирьох країнах: США, Аргентині, Канаді та Чилі [1]. У США площа полів Bt-кукурудзи в 2000 р. становила понад 8 млн га (близько чверті плантацій), а Bt-бавовни - 2.4 млн га (близько половини посівів). Економічна користь таких рослин очевидна: за оцінкою Агентства з захисту навколишнього середовища США (US Enviromental Protection Agency), використання в цій країні тільки Bt-зернових культур призводить до щорічного скорочення застосування синтетичних інсектицидів на площі приблизно 3 млн га і дозволяє заощадити 2.7 млрд дол США [1].

Про можливого негативного впливу трансгенних сільськогосподарських культур на навколишнє середовище до недавнього часу лише боязко попереджали екологи. Прихильники ж генетичної модифікації рослин, навпаки, переконували в їх повної екологічної безпеки, спираючись на результати лабораторних тестів і досвід вирощування цих культур в природних умовах. (Як згодом виявилося, що застосовувалися в деяких лабораторних експериментах методики та об'єкти тестування були не адекватні поставленим завданням, але про це трохи пізніше.) Лише зараз, через десятиліття після початку промислового вирощування трансгенних культур, стає більш-менш очевидно, якого роду вони можуть завдавати шкоди навколишньому середовищу.

З'являється все більше свідчень того, що використання Bt-рослин може мати довгостроковий негативний ефект, економічний збиток якого поки що навіть важко оцінити. По-перше, Bt-кукурудза виробляє в 1.5-2 тис. разів більше ендотоксин, ніж вноситься при одноразової обробці полів хімікатами, що містять Bt-токсин. По-друге, культивування Bt-кукурудзи призводить до накопичення Bt-токсинів в грунті в результаті дії багатьох чинників: виділень коріння, відкладення пилку, розкладання рослинних залишків. По-третє, розкладання трансгенних рослин відбувається значно повільніше, ніж звичайних культур, а біологічна активність грунтів, зайнятих генетично модифікованими рослинами, помітно нижче, ніж на контрольних ділянках.

Bt-токсини в грунті

Після збору врожаю трансгенної кукурудзи близько десяти відсотків Bt-токсинів залишається на полях в рослинних рештках. І тільки з їх розкладанням відбувається і деградація Cry-білків у природних умовах. За даними швейцарських дослідників, концентрація токсину Cry1Ab в рослинних залишках різко скорочується (до 20-38% від кількості в живих рослинах) через два місяці після збирання врожаю і залишається приблизно на тому ж рівні протягом зими [2]. Лише з настанням весни починається подальша деградація Bt-токсину, однак і після закінчення 200 днів 0.3% від початкового його кількості залишається на полях. Максимальний же термін, протягом якого зберігаються Cry-білки, що опинилися в грунті в результаті виділень коріння і розкладання рослинних залишків, досягає 350 днів [3]. Bt-токсини залишаються біологічно активними протягом такого тривалого часу (фактично до року) завдяки тому, що знаходяться у зв'язаному стані з поверхнево активними грунтовими частками (глини, гумусу і т.д.); це-то і захищає їх від розкладу мікроорганізмами.

Ці результати отримані порівняно недавно і принципово відрізняються від більш ранніх, проведених в лабораторних умовах, коли було встановлено, що 50% Bt-токсинів розкладаються через півтора дня після попадання в грунт і 90% - протягом 15 днів. У разі якщо рослинні залишки не контактували з грунтом, то 50%-й розпад Cry-білків спостерігався протягом 25.6 днів, а 90% - 40.7 днів [4]. Настільки сильні відмінності в швидкості розкладання Bt-токсинів, очевидно, пов'язані з тим, що в лабораторних умовах експерименти проводилися при постійній кімнатній температурі, у той час як у природі окрім холодного зимового періоду, характерного для середньої смуги, де і виростає в основному трансгенна кукурудза, спостерігаються і добові коливання температур. Крім того, в лабораторних експериментах листя кукурудзи перемелювалися, просівали і ліофілізований, що забезпечувало істотно більшу площу для колонізації мікроорганізмами. Природно, нічого подібного в природі не відбувається, і зрозуміло, що екстраполювати результати лабораторних дослідів з Bt-токсинами на природні умови необхідно вкрай обережно.

Хоча надходження в грунт Cry-білків з виділеннями коренів трансгенних рослин не така велика, як після розкладання рослинних залишків, що залишилися на полях після збору врожаю, але і цей чинник не можна скидати з рахунків. Цікаво відзначити, що якщо кореневі відростки каноли, тютюну і бавовни взагалі не виділяють Bt-токсинів [1], то всі 12 досліджених трансгенних сортів кукурудзи, отриманих за допомогою трьох незалежних генно-інженерних операцій (Bt11, MON810 і Bt176), продукують Cry-білки практично в однакових кількостях [3]. Крім того, інсектицидні активність виділень кукурудзи була найбільшою - достовірно більш високою, ніж у рису і картоплі. Хоча деяку кількість Cry-білків може потрапити в грунт і в результаті лущення або механічного пошкодження коренів, але саме з їх виділеннями надходить у грунт основна частина Bt-токсинів. На підтвердження цього досить сказати, що в кукурудзи, рису і картоплі, вирощуваних на гідропоніці, ніяких порушень кореневої поверхні не відзначалося, тим не менше Cry-білки в живильному розчині все ж реєструвалися.

лігнін

Помічено, що рослини з високим вмістом Bt-токсинів не привабливі навіть для тих фітофагів, для яких ці токсини не отруйні. Так, в експериментах з Погрібний, або шорсткою, мокрицей (Porcellio scaber), якою пропонувалися в їжу вісім сортів кукурудзи (два трансгенних і шість ізогенних їм контрольних ліній), з'ясувалося, що це тварина явно віддає перевагу нетрансгенного рослини [5]. Крім того відомо, що рослинні залишки трансгенних рослин розкладаються значно повільніше в порівняно з генетично немодифікованими ізогеннимі лініями. Причини цього в даний час вивчаються. Передбачається, що пов'язано це з підвищеним змістом лігніну в трансгенних рослинах. Можливо, цим же пояснюється і їх харчова непривабливість, однак, на жаль, автори не досліджували зв'язок між цими сортами кукурудзи і вмістом у них лігніну.

лігніну - високомолекулярна підключення ароматичною природи - основний структурний компонент рослин, що заповнює простір між клітинами і "склеюють" їх первинні оболонки. Саме лігнін забезпечує міцність і жорсткість рослинних конструкцій, а також їх водонепроникність. З одного боку, підвищений вміст лігніну ускладнює "роботу" фітофагів, з іншого боку, уповільнює процеси розкладання рослинних залишків у грунті. При розкладанні лігніну в середу виділяються токсичні низькомолекулярні продукти розпаду (феноли, метанол, карбонові кислоти).

Зміст лігніну в стеблах Bt-сортів кукурудзи на 33-97% вище, ніж у ізогенних їм нетрансгенного лініях [6]. Великий розкид даних пов'язаний з різним вмістом лігніну в трьох основних лініях трансгенної кукурудзи. Надлишок лігніну проявлявся і на морфологічному рівні. Судинні пучки і навколишні їх клітини склеренхіми, до складу яких входить лігнін, були в Bt-рослин майже в два рази товще, ніж у ізогенних нетрансгенного ліній (21.5 ± 0.84 мм та 12.4 ± 1.14 мм відповідно). Підвищений накопичення лігніну характерно лише для стебел Bt-кукурудзи, у листі ж його кількість приблизно те ж, що й у звичайних рослин [7].

Крім того, з'ясувалося ще одне цікаве обставина: лігніну виявилося більше в кукурудзі, вирощеної в природних умовах, ніж в лабораторних. Це зайвий раз підтверджує, що в штучній середовищі трансгенні рослини розвивається інакше, ніж у природі.

У результаті подальших досліджень з'ясувалося, що надлишок лігніну характерний не тільки для Bt-кукурудзи, це загальна властивість всіх трансгенних рослин. У різних генетично модифікованих культурах (рисі, тютюн, бавовні і картоплі) лігніну на 10-66% більше, ніж у відповідних їм генетично не модифікованих ізогенних лініях [8].

Дощові черв'яки

Одні з головних утилізаторів рослинного опадами в середній смузі - дощові черв'яки, в основному з сімейства люмбріцід (Lumbricidae). Зустрічаються вони практично у всіх природних і антропогенних екосистемах помірного поясу і домінують у них по біомасі (особливо висока їх чисельність в лісостепу, змішаних і широколистяних лісах - більше 300 особин на 1 м2). Пронизуючи грунт ходами, дощові черв'яки спушують її, сприяючи аерації та зволоження на глибині, перемішують грунтові шари, прискорюючи розкладання рослинних залишків і підвищуючи тим самим родючість грунту. Обсяг переносимої цими тваринами грунту коливається від 2 до 250 т/га на рік. Вертикальне розподіл дощових черв'яків вздовж грунтового профілю визначається, з одного сторони, їх екологією, а з іншого боку - комплексом абіотичних факторів, таких як температура, вологість грунту, вертикальний градієнт розподілу органічних речовин.

Токсини можуть діяти на дощових черв'яків по-різному, залежно від виду люмбріцід і стадії їх розвитку. Ювенільні особи, не здатні йти глибоко в грунт, страждають від полютантів сильніше, ніж статевозрілі. Але й одна з найбільших видів люмбріцід середньої смуги -- великий виползок (Lumbricus terrestris) - як не дивно, також знаходиться в "групі ризику". Справа в тому, що особини цього виду, вдень ховаючись в глибоких (до 3 м) норах, уночі виходять на поверхню грунту за їжею -- рослинним опадами (у Росії за такий спосіб життя цей космополіт отримав народна назва "великого виползка"). Справедливості заради відзначимо, що невелику частину їхньої дієти складають і коріння рослин. Під час таких нічних подорожей деякі особи можуть долати до 19 м. Приблизно кожна третя траса закінчується норою, а кожна чотирнадцята - нори є і на початку шляху. У різних екосистемах за кілька осінніх місяців ці дощові черв'яки здатні забрати в нори практично весь рослинний опад. Це зовсім не означає, що люмбріціди відразу ж все з'їдають, істотну частину їжі вони запасають в норах і споживають у міру часткового розкладання рослинних залишків. Саме ці особливості екології великого виползка і визначають високий рівень його контакту як з поллютантами, що осідає на полях, так і з трансгенними рослинами.

Люмбріціди розвиваються в товщі грунту і, природно, реагують на зміни її хімічного складу, зокрема попадання забруднюючих речовин, які здатні проникати в їх організм через покриви. З огляду на особливості харчування, дощові черв'яки можуть заковтувати з частками грунту і що містяться в них токсини, а отже, можуть піддатися їх впливу як зовні, так і зсередини.

Як не дивно, грунтовних досліджень токсичності Cry-білків для дощових черв'яків до цих пір не проводилося. Щоправда, близько півстоліття тому при перевірці токсичності для люмбріцід препарату Thuricide, містить B.thuringiensis var. kurstaki, встановлено, що тільки дуже високі його концентрації (у 10 тис. разів перевищують рекомендовані для обробки полів) протягом двох місяців викликали 100%-ю смертність лабораторних популяцій L.terrestris [9]. Здавалося б, ці дані мають лише непряме ставлення, але ж що виявилися смертельними дози лише в п'ять-десять разів перевищували концентрацію Bt-токсинів в живих трансгенних рослинах. Гістологічні дослідження загиблих люмбріцід показали, що бактерії проникли практично у всі тканини черв'яків, де відбулася їх споруляція і формування кристалів. Пізніше така незвичайна патологія була пояснена тим, що в дослідах використовувалася діатомових земля, яка, пошкоджуючи епітелій кишечника, сприяла проникненню бактерій в цілому (простір між стінкою тіла і внутрішніми органами) дощових черв'яків.

В іншій серії експериментів вивчалося дію пестицидів, що містять Bt-токсин, на дощового хробака Dendrobaena octaedra: десятитижневий вплив токсину в дозах, в тисячу разів перевищували польові і приблизно рівні концентрації токсинів в живих рослинах, призводило до істотного пригнічення росту і розмноження, а також більш високої смертності черв'яків [10]. На жаль, в цих дослідах використовувався вигляд, який не має ніякого відношення до полів (зазвичай вона живе в лісовій підстилці) і в природних умовах не може стикатися з трансгенними культурами.

Одним з перших екотоксікологіческіх дослідів по вивченню впливу трансгенних рослин на дощових черв'яків став стандартний лабораторний тест з використанням штучної грунту і гнойового хробака (Eisenia fetida). Виявилося, що екстракти листя трансгенної кукурудзи, містять Bt-токсин, ніяк не впливають на виживання і розвиток цих люмбріцід -- всі вони дожили до кінця 14-денного експерименту і за масою тіла не відрізнялися від контрольних тварин. За розрахунками авторів, використана в досвіді концентрація Bt-токсину (0.35 мг CryIA (b)-білків на 1 кг грунту) була приблизно в 785 разів вища за ту, яка могла б скластися в грунті після збирання врожаю [11]. Ці результати мали б сенс, якби вибір виду дощового хробака був адекватний поставленим цілям. Автори не врахували, що E.fetida, як і D.octaedra, в природних умовах не стикається з трансгенними культурами. Не кажучи вже про те, що гнойовий черв'як на відміну від власне грунтових видів не заковтує грунтових часток, а харчується розкладається органікою, тому незрозуміло, яке кількість Bt-токсинів потрапило в його травну систему і потрапило взагалі.

40-денні спостереження за лабораторними популяціями L.terrestris, що жили в грунті, в якій пророщували насіння трансгенної кукурудзи або додавалися її листя, не виявили значущих змін ні в масі тіла, ні в смертності великих виползков, хоча Bt-токсини і були виявлені в їх кишечниках і кастах (екскрементах). Коли черв'яки переносилися в чистий грунт, у протягом одного-двох днів їх кишечнику звільнялися від токсину [12]. До жаль, автори цієї роботи не оцінювали вплив Bt-токсинів на розмноження люмбріцід, а також на ювенільні, більш чутливі до токсинів, особи. Крім цього, для такого великого і живе не один рік дощового хробака-норніка, як великий виползок, 40-денний термін явно недостатній для виявлення сублетальлними ефектів. В іншому, проведеному трохи пізніше, аналогічному експерименті, але тривав вже 200 днів, з'ясувалося, що маса тіла L.terrestris, що харчувалися трансгенними рослинними залишками, знижувалася в середньому на 18%, у той час як у контрольної групи вона на 4% підвищувалася [13].

На жаль, поки ще не досліджувалася міграція Bt-токсинів в трофічних ланцюгах, в яких дощові черв'яки служать кормовою базою для багатьох хижих безхребетних, птахів і ссавців. Наприклад, в Англії в раціоні рудих лисиць (Vulpes vulpes) великий виползок складає в середньому 10-15%, а на ділянках, де цих дощовиххробаків особливо багато, - до 60%. Не гидуватиме великими виползкамі і звичайна сіра сова (Strix aluco), яка за годину може зловити більше 20 черв'яків. Відзначено і особлива любов до L.terrestris і у європейського борсука (Meles meles); більше 20 років тому їх навіть визнали спеціалізованими хижаками дощових черв'яків. Згодом гіпотеза була відкинута, але справедливості заради відзначимо, що в деякому роді спеціалізація у цього хижака все-таки є, - виявляється вона в техніці захоплення їжі.

Для грунтових мікроорганізмів (як чистих, так і змішаних культур) токсичність Cry-білків не виявлено; кількість бактерій і грибів у грунтах, що містять біомасу генетично модифікованою та нетрансгенного кукурудзи, статистично не відрізнявся. Однак в експериментах з грунтовими мікрокосму, в яких були відсутні грунтові безхребетні, показано, що і в цьому випадку біодеградація Bt-культур (кукурудзи, рису, тютюну, бавовни і томатів) відбувається значно повільніше в порівнянні з контролем. Про це свідчило значно менша кількість вуглецю, що іде з експериментальних грунтових мікрокосмом у вигляді CO2, у порівнянні з контролем [8].

* * *

Знижена швидкість розкладання трансгенних рослинних залишків вимагає подальшого та всебічного дослідження, оскільки потенційний збиток від цього іманентного властивості Bt-культур може мати віддалені екологічні наслідки. Ще більш пильної уваги вимагають особливості міграції Cry-білків по харчових ланцюгах. І, нарешті, з'являється все більше даних про те, що популяції шкідників сільського господарства починають виробляти стійкість до Bt-токсинів і починають харчуватися трансгенними рослинами.

Виявлення Bt-токсинів в кореневих виділеннях кукурудзи, рису та бавовни і їхнє тривале збереження в грунті говорить і про те, що особливі запобіжні заходи повинні бути прийняті перед тим, як рослини і тварини, генетично модифіковані з метою виробництва лікарських (антибіотиків, вакцин, гормонів, ферментів) та інших біологічно активних речовин, будуть залишати стіни лабораторій та надаватися в менш контрольованих умовах промислового виробництва. На відміну від Bt-рослин, мішені цих сполук - не комахи, а ссавці, в тому числі і люди. Практично всі ці речовини - ксенобіотики, але їхня здатність зберігатися в навколишньому середовищі досліджена недостатньо. Ясно тому, що потенційний збиток вирощування в навколишньому середовищу синтезують їх трансгенних рослин навіть приблизно оцінити неможливо.

Список літератури

1. Saxena D., Stotzky G. Release of Larvicidal Cry Proteins in Root Exudates of Transgenic Bt Plants. ISB News Report. 2005. February. P.1-3.

2. Zwahlen C., Hilbeck A., Gugerli P. et al.// Mol. Ecology. 2003. V.12. № 3. P.765-775.

3. Saxena D., Flores S., Stotzky G.// Soil Biol. and Biochemistry. 2002. V.34. P.133-137.

4. Sims S.R., Holden L.R.// Environmental Entomology. 1996. V.25. P.659-664.

5. Wandeler H., Bahylova J., Nentwig W.// Basic and Applied Ecology. 2002. V.3. № 4. P.357-365.

6. Saxena D., Stotzky G.// Amer. J. of Botany. 2001, V.88. № 9. P.1704-1706.

7. Poerschmann J., Gathmann A., Augustin J. et al.// J. Environ. Qual. 2005. V.34. № 5. P.1508-1518.

8. Flores S., Saxena D., Stotzky G.// Soil Biol. and Biochem. 2005. V.37. № 6. P.1073-1082.

9. Smirnoff W.A., Heimpel A.M.// J. of Insect Pathology. 1961. V.3. № 403-408.

10. Addison J.A., Holmes S.B.// Canad. J. of Forest Res. 1996. V.26. P.1594-1601.

11. Ahl Goy P., Warren G., White J. et al. Interaction of an insect tolerant maize with organisms in the ecosystem// Proceedings of the Key Biosafety Aspects of Genetically Modified Organisms. 10-11 April 1995. V.309. P.50-53. Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt fьr Land-und Forstwirtschaft, Berlin-Dahlem, Blackwell, Berlin, 1995.

12. Saxena D., Stotzky G.// Soil Biol. and Biochem. 2001b. V.33. P.1225-1230.

13. Zwahlen C., Hilbeck A., Howald R. et al.// Mol. Ecology. 2003b. V.12. № 4. P.1077-1086.

Для підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://vivovoco.rsl.ru