Електричні реакції
очі черевоногих молюска Lymnaea stagnalis L.
С.Л. Борисенко
Мікроелектродное
дослідження очі Lymnaea stagnalis виявило два типи електричних сигналів:
постійна потенціал і його зміни у відповідь на світлову стимуляцію (ерг).
Встановлено, що полярність фаз ерг не залежить від точки на поверхні очного
келиха, в якій проводилося занурення мікроелектроди в сітківку. Порівняння
динаміки компонентів ерг дозволяє зробити припущення про їх різному
походження, а також про існування профілю полярності і амплітуди ерг по
товщині сітківки.
Вступ
Камерний
очей черевоногих молюсків порівняно рідко виступає об'єктом
електрофізіологічних досліджень. Можна вказати лише на невелике число
праць, в яких проводилася реєстрація електроретинограми (ерг) або
електричних відповідей фоторецепторных клітин сітківки ока морських і сухопутних
видів [1]. Тому логічним видається постановка такої експериментальної завдання
по відношенню до ока прісноводного легеневого молюска. Об'єктом цієї
роботи був обраний великий прудовік Lymnaea stagnalis. Камерний очей цього
молюска має будову, типове для черевоногих, і включає в себе рогівку,
кришталик, склоподібне тіло і одношарову сітківку з мікровіллярнимі
фоторецепторными клітинами [2]. Особливістю будови є геометрія
сітківки, внутрішня поверхня якої утворює характерні поглиблення --
дорсальну і більш глибоку вентральній ямки [3].
Раніше
була описана ерг, отримана всмоктуючим електродом в області основи
очного келиха в місці формування оптичного нерва [4]. У даній роботі
проводилася мікроелектродная реєстрація електричних сигналів очі в
різних топографічних точках. При цьому ставилося за мету - отримати
уявлення про просторове розподіл електричних потенціалів в
очному бокалі в умовах темнової адаптації та при генерації відповіді на світлову
стимуляцію.
Матеріали та методи
Об'єкт
дослідження. Дорослі особини Lymnaea stagnalis L. з раковиною висотою 2 см були
зібрані ставках Калінінграда і утримувалися в ємностях з відстояною водопровідної
водою. Світловий режим 12 С: 12 Т встановлювали лампами розжарювання.
Препарат.
Око розміром близько 300 мкм по поздовжній і 200 мкм по поперечної осі з
обрубком оптичного нерва довжиною близько 700 мкм виділяли під червоним світлом
(фільтр КС-10).
Препарат
ізольованого очі фіксували в експериментальній камері за що відходять від
нього пучки колагенових волокон вольфрамовим голками, заточеними
електролітичні. При цьому апертурною отвір очі орієнтували назустріч
стимулюючого світлового потоку.
Фізіологічний
розчин (мМ): NaCl - 40; KCl - 3; CaCl2 - 3; MgCl2 - 1; рН = 7,5 підтримували
карбонатною буфером [5].
Електрофізіологічне
установка. Експерименти проводилися в електрофізіологічне установки,
що складається з вимірювального комплексу для роботи з мікроелектродами, цифрового
осцилографа С9-8 і чорнильного графобудівники Н306.
Світлова
стимуляція здійснювалася джерелом світла (лампа КГМ-150) з регульованим
напруженням. Світлові стимули тривалістю 0,5 с формували
електромеханічним затвором, яким керували електронним стимулятором ЕС-50
- 1. Після проходження абсорбційних фільтрів (ФИ-05) світловий пучок по
оптоволоконному кабелю направляли до препарату і фокусували на ньому.
мікроелектроди
з діаметром кінчика менше 1 мкм виготовляли на горизонтальній кузні Leitz.
Електроди заповнювали 3 М розчином KCl. Опір мікроелектродной системи в
фізіологічному розчині було близько 15 - 20 МОм і контролювалося перед кожним
зануренням мікроелектроди.
Хід
експерименту. Позиціонування мікроелектроди проводили при червоному світлі,
подається через световолоконний палять, забезпечений фільтром КС-10. Після
темнової адаптації тривалістю 30 хв здійснювали занурення мікроелектроди
до появи стійкої різниці потенціалів і проводили контрольне освітлення
препарату. Якщо відповіді не було, занурення продовжували.
В
ході кожного експерименту проводили серію послідовних реєстрацій уздовж
довгої осі очного келиха, починаючи від краю рогівки і до закінчення області
нейропіля. Точки відведення на різних препаратах вибирали візуально - орієнтуючись
щодо меж пігментного шару очного келиха. З достатньою
упевненістю вдалося ідентифікувати три основні точки відведення потенціалу
(рис. 1, 2). Для кожної точки проводили послідовно три - чотири
Рис.
1. Приклади ерг, отримані мікроелектродним відведенням
в
області рогівки (а) і середній частині очного келиха Lymnaea stagnalis (б).
Точки занурення мікроелектроди показані на вставці.
Відмітка
стимуляції спільна для всіх наведених ерг
електричних
відповіді на світлову стимуляцію. У зв'язку з тим, що тривалість реєстрації
електричних потенціалів очі була обмежена (сеанс реєстрації з кожної
точки, як правило, не перевищував 20 - 30 хв), відведення від всіх трьох точок
отримані не для кожного препарату. Але на 12 препаратах вдалося провести у всіх
точках весь набір відведень. Всього було досліджено 72 препарату та вироблено
229 записів ерг.
Рис.
2. Приклади ерг, отримані мікроелектродним відведенням
в
області нейропіля очного келиха Lymnaea stagnalis.
Місце
занурення мікроелектроди вказано на вставці.
Для
кожного стовпця записів показана загальна позначка стимуляції
Результати
Було
зареєстровано два види електричних сигналів: постійний потенціал (ПП)
позитивного або негативного знака щодо індиферентного електрода
і його швидкі зміни у відповідь на світлову стимуляцію - Ерг, яка могла
складатися з одного або декількох повільних компонентів (хвиль) і більш швидких
піків. Вживається при описі ерг термінологія - негативний або
позитивний компонент (хвиля чи пік) - відноситься до напрямку зміщення
потенціалу під час відповіді щодо початкового ПП. Нижче слідує опис
відповідей, отриманих у різних точках очного келиха.
Область
рогівки. При проколі мікроелектродів в районі рогівки фіксували
позитивний ПП амплітудою до 12 мВ. Хвиля ерг з однаковою ймовірністю могла
мати як позитивну (амплітуда до 3 мВ, рис 1а 1), так і негативну
(амплітуда до 10 - 11 мВ, рис. 1а 2) полярності. Фаза реполяризації більше
повільна, ніж відповідний компонент ерг в нейропіле. Занурення електрода
призводить до збільшення позитивного значення потенціалу. Швидких змін
потенціалу на тлі розвивається Ерг, характерних для області нейропіля,
зафіксовано не було. Зареєстрована в цій галузі форма ерг була
найбільш стабільною в порівнянні з відведеннями в інших точках: з часом
спостерігалося лише зміна амплітуди при збереженні напрямку та динаміки фаз.
У цій точці була отримана 61 ерг.
Середня
частину очного келиха. При проколі келиха реєстрували невеликий
позитивний ПП до двох мВ, який при тривалому знаходженні електрода в цій
точці міг падати до нуля. Ерг, отримані в цих точках, мали вигляд хвиль, серед
яких зустрічалися як позитивні, так і негативні. Були
зареєстровані дво-і трифазні хвилі ерг (мал. 1б 1 - 3) При подальшому
зануренні мікроелектроди ПП падав до нульового значення, разом з тим
зменшувалась і амплітуда ерг без помітного спотворення фаз. У цій частині келиха
було отримано 69 ерг.
Нейропіль.
На перших етапах занурення електрода в очній келих спостерігався негативний
ПП величиною до 10 мВ. У цій точці реєстрували ерг, принаймні, трьох
видів.
1.
Негативна монофазні хвиля амплітудою до 7 мВ, що складається з відносно
швидкого зміщення потенціалу і більш повільного його повернення до початкового
значенням (реполяризації) (рис. 2 4). Такий вигляд мали близько 45% з 99
зареєстрованих у цій точці ерг.
2.
У стількох же випадках реєстрували схожу по кінетики позитивну хвилю
Ерг амплітудою до 8 мВ (рис. 2 3).
3.
У 10% випадків повільні хвилі ерг поєднувалися зі швидкими коливаннями, не
прив'язаними до певної фазі хвилі. Серед них швидкі негативні (мал. 2
6) і позитивні піки (рис. 2 2, 5) з негативною повільної подальшої
хвилею, а також безлічі позитивних піків на тлі загальної повільної
деполяризації (рис. 2 1). З часом форма ерг цих піків могла
змінюватися. Спостерігаються зміни стосувалися як амплітуди, так і (іноді)
полярності компонентів відповідей (рис. 3). При подальшому зануренні електроду
спочатку спостерігали збільшення ПП і амплітуди фаз Ерг, а потім - зменшення обох
сигналів.
Обговорення
Завдання реєстрації електричних сигналів від
різних ділянок ізольованого очі черевоногих молюска ставилася і
перш. Дослідженнями на Strombus luhuanus [6] і Helix aspersa [7] показано,
що полярності фаз Ерг, одержуваних електродами-присосками від основи очного
келиха і області рогівки, протилежні. Переміщення електроду всередині
очного келиха від мікровіллярного шару очі H. aspersa до рогівці також
супроводжується інверсією полярності хвилі ерг з негативної на позитивну
[7]. Зміна полярності фаз ерг в залежності від положення реєструючого
електрода-присоски спостерігалася також і в дослідженнях на Achatina fulica. При
цьому в області бічній поверхні келиха була отримана двофазна Ерг,
що складається з швидкого піку позитивної і подальшою повільною негативною
хвилі [8]. У своїх дослідах ми отримали результат, що суперечить на першу
погляд з наведеними даними. Так, у незалежних експериментах при зануренні
мікроелектроди в топографічно близькі точки очного келиха могла бути отримана
різна полярність компонентів ерг. Більш того, як виявилося, при тривалій
реєстрації в одному і тому ж положенні мікроелектроди форма і полярність
компонентів ерг могли зазнавати зміни. Причину спостерігається динаміки
можна вбачати в тому, що в різних відведеннях кінчик мікроелектроди був
занурений у сітківку на різну глибину. При тривалій ж реєстрації
сили деформації м'якої тканини очі, що виникли при зануренні мікроелектродами,
могли викликати її поступове просування і, таким чином, зміщення глибини точки
реєстрації щодо початкового положення в бокалі. Якщо таке
міркування справедливо, то слід визнати наявність залежності амплітуди і
полярності ерг від глибини занурення електрода, як це було показано на прикладі
очі комах, що у порівнянні з молюсками має більш жорстку
структуру, що дає можливість пошарового аналізу електричних сигналів. Таким
методом був отриманий профіль постійного потенціалу, що корелює з амплітудою
Ерг [9]. Для пояснення існування піків в профілі постійного потенціалу, а
також точки реверсії амплітуди ерг був використаний підхід до ока комахи
як об'ємному провіднику, який містить багато джерел струму. Передбачалося
існування декількох контурів темнового струму, розбалансування яких при
освітленні призводить до виникнення компонентів ерг. Зокрема, такі струми
можуть генеруватися послідовно розташованими на шляху занурення
мікроелектроди фоторецептора і нейронами ламіни. У структурі сітківки L. stagnalis
можна вказати, принаймні, на два типи клітин, які могли б
генерувати струми і робити внесок у формування ерг: безпосередньо
фоторецепторные і нервові клітини [2]. Ультраструктурних дослідженнями
функціональний зв'язок між цими клітинами до цих пір не встановлено [2, 10], і
припущення про те, що в сітківці L. stagnalis саме в клітинах другу
порядку формується імпульсний сигнал у відповідь на висвітлення сітківки,
грунтується на електрофізіологічних даних [11]. Саме питання про те, в яких
клітинах очі черевоногих молюсків відбувається генерація що розповсюджується
потенціалу дії, є важливим для розуміння функціональної організації
сітківки цих тварин. Імпульсна активність фоторецепторных клітин виявлена
в сітківці Голожаберний молюсків Aplysia californica [12] і Hermissenda
crassicornis [13, 14], а також у світлочутливих клітинах малого ганглія
заднежаберного Clione limacina [15]. Фоторецептори S. luhuanus [16] і A. fulica
[8] відповідають на освітлення лише градуальнимі змінами мембранного потенціалу
і імпульсний відповідь формується найімовірніше в клітинах другого порядку. Нам
не вдалося виявити явних ознак потенціалів дії в електричних
відповідях на висвітлення очі L. stagnalis, хоча в складі Ерг, отриманої від
області нейропіля, часто були присутні швидкі піки, поява яких може
бути зобов'язана синхронного збудження нейронів. Можна вважати, що зони
генерації потенціалів дії локалізовані головним чином саме в цій
області. Таке припущення може пояснити той факт, що ерг, отримані в
області рогівки або середній частині очного келиха, практично не містять
швидких піків. В усякому випадку порівняно незалежне зміна швидких і
повільних компонент ерг наводить на думку про те, що вони можуть генеруватися
різними елементами сітківки.
Світлові
відповіді деяких фоторецепторів S. luhuanus містять фази швидкої і більше
повільної деполяризації, остання з яких, ймовірно, має синаптичному
походження [17]. Реакції на світ фоторецепторів Голожаберний молюсків A.
californica [12] і H. crassicornis [13, 14] ще більш різноманітні, частково
внаслідок взаємодії клітин сітківки. Якщо врахувати, що в сітківці L.
stagnalis можна виділити два морфологічних типу фоторецепторных клітин [2],
то можна розмірковувати про їх відносному внесок у ерг. Все ж таки очевидно, що
питання про різний клітинному походження компонентів електричного відповіді і
функціональної гетерогенності сітківки L. stagnalis вимагає детального її
дослідження, і результати, отримані нами, являють собою лише перший крок
в цьому напрямку.
Список літератури
1. Messenger J.B. Comparative
physiology of vision in molluscs// Handbook of sensory physiology/Ed. H.
Autrum. Berlin; Heidelberg; New-York: Springer-Verlag. 1981. 7/6C. P. 93 - 200.
2. Бобкова М.В. Структурно-функціональна організація периферичного відділу зорової системи прудовіка звичайного Lymnaea stagnalis// Журн. Евола. біохімії. і фізіолого. 1998. 34 (6). С. 716 - 731.
3.
Вона ж. Форма сітківки, структура кришталика і природа екрануючого пігменту
очі Lymnaea stagnalis// Журн. Евола. біохімії. і фізіолого. 1996. 32 (1). С. 109 --
112.
4.
Жуков В.В., Грібакін Ф.Г. Спектральна чутливість очі молюска Lymnaea
stagnalis і Planorbarius corneus в ультрафіолетовій і видимій області спектра
//Сенсорні системи. 1990. 4
(4). С. 341 - 350.
5. Suzuki H., Watanabe M., Tsukahara
Y., Tasaki K. Duplex system in the simple retina of a gastropode mollusc Limax
flavus L.// J. comp. physiol. 1979. Vol. 133. P. 125 - 130.
6. Gillary H.L. Light-evoked
electrical potentials from the eye and optic nerve of Strombus: response
waveform and spectral sensitivity// J. exp. biol. 1974. Vol. 60. P. 383 - 396.
7. Idem. Electrical responses from
the eye of Helix to photic stimulation and simultaneous electrical stimulation
of the optic nerve// Vision Res. 1970. Vol. 10. P. 977 - 991.
8. Tamamaki N. Visible light
reception of accessory eye in the giant snail, Achatina fulica, as revealed by
an electrophysiological study// Zoological science. 1989. Vol. 6. P.
867 - 875.
9.
Грібакін Ф.Г. Механізми фоторецепції комах. Л.: Наука, 1981.
10. Stoll C.J. Observations on the
ultrastructure of the eye of the basommatophoran snail Lymnaea stagnalis (L.)
//Proc. Kon. Ned. Akad. Wet. 1973. Vol. 76. P. 414 - 424.
11. Stoll C.J., Bijlsma A. Optic
nerve activity in Lymnaea stagnalis (L.) to photic stimulation of the eye//
Proc. Kon. Ned. Akad. Wet. 1973. Vol. 76. P. 406 - 413.
12. Jacklet J.W., Rolerson C.
Electrical activity and structure of retinal cells of the Aplysia eye: II.
Photoreceptors// J. exp. biol. 1982. Vol. 99. P. 381 - 395.
13. Dennis M.J. Electrophysiology of
the visual system in a nudibranch mollusc// J. neurophysiol. 1967. Vol. 30. P.
1439 - 1465.
14. Alkon D.L., Fuortes M.G.F.
Responses of photoreceptors in Hermissenda// The j. gen. physiol. 1972. Vol.
60. P. 631 - 649.
15. Аршавський Ю.И., Орловский Г.Н., Панчін Ю.В. Електрофізіологічне дослідження фоторецепторных клітин у
заднежаберних молюсків Clione limacina і Coryphella rufibranchialis// Сенсорні системи. 1990. Т. 4 (3). С. 331 - 334.
16. Quandt F.N., Gillary H.L.
Classes of light-evoked response in the retina of Strombus// J. exp. biol.
1979. Vol. 80. P. 287 - 297.
17. Iidem. Separable phases of
light-evoked depolarization in the retina of Strombus// J. exp. biol. 1980.
Vol. 84. P. 137 - 148.
Щоб
підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://elib.albertina.ru
